189286. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejt- és szövetregeneráló anyagok előállítására
1 189 286 . 2 benzil- és p-toluol-szulfonil-csoport (lehasítás nátriummal folyékony ammóniában), tercier butil-csoport (lehasítás sósavval szerves oldószerekben; bróm-hidrogénsavval jégecetben vagy trifluorecetsavban). A tercier butil-csoportot különösen elegáns módon vihetjük be izobuténnel történő savban katalizált éterezéssel. A glikolipideknek a kapott dializátumból történő izolálását és tisztítását A) hidegen etanolos oldatból történő kicsapással; vagy B) bizonyos szerves (pl. lipofil) oldószerekkel történő extrakcióval; majd szervetlen abszorbensen vagy ioncserélőn történő kromatografálással végezhetjük el. A B) extrakció és a kromatografálás közé előnyösen további kicsapásos tisztítási lépést iktathatunk be. Az A) kicsapást előnyösen etanolos oldatban,- 15 °C és -25 °C közötti oldatban végezzük el. A glikolipid kitermelés annál jobb, minél nagyobb az etanol végkoncentrációja. A dializátumhoz célszerűen annyi vízmentes etanolt adunk, hogy a koncentráció legalább 60 térfogat% legyen. A legjobb eredményeket 90 térfogat%-os végkoncentráció mellett kapjuk. A képződő etanolos oldatot az említett hőmérsékleten több órán át állni hagyjuk. A szilárd anyagokat szűréssel, centrifugálással vagy ülepítéssel és dekantálással választjuk el. A terméket végül kíméletes körülmények között - azaz 37 °C-nál nem magasabb hőmérsékleten - szárítjuk. A szárítást melegítéssel vagy vákuumban vagy melegítés és vákuum együttes alkalmazásával hajtjuk végre. A Bj extrakciós lépéshez a dializátumot szárított szilárd formában, vizes oldat alakjában vagy szerves oldószerrel képezett oldat formájában alkalmazhatjuk. Az extrakcióhoz vízzel nem vagy csak korlátozottan elegyedő szerves oldószerek vagy ezek elegyei alkalmazhatók. E célra különösen az alábbi oldószerek bizonyultak előnyösnek: éterek (pl. dietiléter és tetrahidrofurán), szénhidrogének (pl. pentán, hexán, petroléter és benzol), halogénezett szénhidrogének (pl. kloroform, diklór-metán, szén-tetraklorid és 1,2-diklór-etán), kloroformmetanol elegy, alkoholok (pl. butanol és amilalkohol) és karbonsav-észterek (pl. etil-acetát és butilacetát). A fenti extrakciós lépéssel a kiindulási anyagokat folyadék/folyadék fázisokra vagy folyadék/szilárd fázisokra és ily módon a komponenseket kevésbé poláros vagy apoláros és poláros vagy ionos anyagokra választjuk szét. A kívánt glikolipidek a kevésbé poláros szerves fázisba mennek át. A szerves fázist a másik folyadékfázistól vagy szilárd fázistól való elválasztás után a fentiekben leírt módon kíméletesen megszárítjuk. Az extrakció után a glikolipideket előnyösen kicsapjuk, fémsók vizes oldataiban mutatott oldékonyságuk alapján. A kicsapást acetonban, dietiléterben vagy ezek elegyében vagy pedig etanolban- 15 °C és - 25 °C közötti hőmérsékleten végezzük el. A vizes oldat valamely szervetlen sav 1-5 vegyértékű fémmel képezett sóját (előnyösen fémsóját) tartalmazza. Sóként előnyösen magnézium-kloridot, kálcium-kloridot, nátrium-kloridot, káliumkloridot, ammónium-szulfátot, nátrium-szulfátot, kálium-szulfátot, nátrium-nitrátot, dinátriumhidrogén-foszfátot és nátrium-dihidrogén-foszfátot alkalmazhatunk. A vizes oldat koncentrációja a telítődésig bármilyen érték lehet. A szárításnál viszszamaradó anyagot ebben az oldatban szuszpendáljuk vagy oldjuk. Aceton és dietiléter elegyet is alkalmazhatunk, azonban előnyösen acetont vagy dietilétert vagy hidegen etanolt használhatunk. A képződő szuszpenzióhoz vagy oldathoz többszörös térfogatú oldószert adunk, majd az elegyet jól összekeverjük. A képződő csapadék tartalmazza a glikolipideket. A csapadékot a folyadékfázistól elválasztjuk (pl. szűrés, centrifugálás vagy ülepítés és dekantálás útján). A terméket végül kíméletesen szárítjuk. Ez a módszer a kicsapási lépés első foganatosítási módja. Amennyiben az oldhatósági viszonyok a glikolipideknek aceton és éter elegyéből vagy hidegen etanolból és vizes fém-só-oldatokból történő kicsapásához megfelelőek, a termék kiválása bekövetkezik. Bizonyos esetekben - különösen ha kiindulási anyagként vért alkalmazunk - a fázis-szétválasztással kapott termék megfelelő koncentrációban sókat is tartalmaz és ilyen esetekben a kicsapást önmagában acetonnal vagy éterrel vagy etanollal hidegen végezhetjük el. Ennél a módszernél tehát fém-sót vagy fém-só-oldatot nem adunk külön hozzá. Ez a módszer a kicsapási eljárás második foganatosítási módja. A harmadik foganatosítási mód szerint az extrakciót és kicsapást ugyanabban a munkalépésben végezzük el. A dializátumot a fent említett, vízzel nem vagy csak korlátozottan elegyedő oldószer és aceton vagy éter elegyével kezeljük. Az oldószerelegy mennyiségét és komponenseinek térfogatarányát a dializátum térfogatának és fém-só koncentrációjának megfelelően választjuk meg és ily módon csapjuk ki a glikolipideket. A csapadékot a folyékony fázisoktól a fentiekben ismertetett módon elválasztjuk és kíméletesen szárítjuk. Az utolsó eljárási lépésben az A ) etanolos kicsapásnál vagy B) extrakciónál kapott terméket kromatográfiás tisztításnak vetjük alá. E célra szervetlen abszorbenseket alkalmazhatunk, különösen kovasavgélt vagy kovasavgél és valamely fém-oxid vagy szervetlen savas só keverékét (pl. a kereskedelmi forgalomban levő kovasavgél és alumíniumoxid, magnézium-oxid vagy magnézium-szulfát keveréke), továbbá ioncserélőket, különösen bázikus és savas cellulóz-származékokat (pl. dietil-aminoetán-cellulózt, karboxi-metil-cellulózt vagy szulfopropil-cellulózt). A terméket előbb kevéssé poláros szerves oldószerben oldjuk. Oldószerként különösen előnyösen metanolt, metanol-kloroform vagy etanol-kloroform elegyet, etil-acetátot, valamint metanol, kloroform és kevés víz elegyét alkalmazhatjuk. Az oldatot abszorbenssel ugyanabban az oldószerben vagy más oldószerben vízmentesen feltöltött kromatografáló oszlopra visszük fel. Az eluáláshoz ugyanazt az oldószert vagy oldószer-elegyet alkal-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
