189246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy enzim és egy antitest kovalens kötés útján létrehozott új konjugátumainak előállítására
1 189 246 2 hogy ezeknek a sejteknek a jelzése TNP-vel megfelelően végbemegy (6. görbe). c) TNP-vel jelzett CEM sejteket először 1 óra hosszat inkubálunk 4 °C hőmérsékleten 1 egység/ ml nem-konjugált ureáz jelenlétében, majd mossuk, 18 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10“3 mól/1 koncentrációjú anti-T65 immuno-toxin szól és 5 mmól/1 karbamid jelenlétében, majd a radioaktiv jelzőanyag beépítésének tesszük ki. Az ebben a vizsgálatban nyert l4C-leucin beépülési érték (65%) megkülönböztethetetlen attól az értéktől, amelyet azonos koncentrációjú anti-T65 immuno-toxinnal nyerünk a b) vizsgálat szerint. Ez az eredmény azt bizonyítja, hogy az inkubálás nem- 1 konjugált ureáz jelenlétében azzal jár, hogy az ureáz nem kötődik a sejthez és ennek eredményeképpen az anti-T65 immuno-toxin hatása nem jut érvényre. d) TNP-vel jelzett CEM-sejteket először 1 óra 2Q hosszat 4 °C hőmérsékleten inkubálunk a fentebb z leírt immuno-enzim konjugátum jelenlétében, amelyet 1,02 egység/ml koncentrációban alkalmazunk. Azt is ellenőrizzük, hogy ennek a konjugátumnak, amikor ilyen körülmények közt használjuk, nincs eredendő citotoxicitása az alkalmazott sejtekre. 5 A sejteket azután mossuk a nem rögzített konjugátum eltávolítása érdekében, majd inkubáljuk 18 órán át 37 °C hőmérsékleten anti-T65 immunotoxin és 5 mmól/1 karbamid jelenlétében. A sejteket végül a radioaktív jelzőanyag beépülésének tesszük 30 ki. Az így nyert IC érték 2,4 ■ 10 11 mól 1 (7. görbe). Ez az érték nagyon jól összehasonlítható azzal az értékkel, amelyet akkor nyerünk, ha az 1. példa szerinti konjugátumot használjuk; ez az immunoenzim konjugátumnak az immuno-toxin hatásának 35 érvényre juttatásában kifejtett jelentős szerepét mutatja. Ez a vizsgálat bebizonyítja, hogy ez az érvényre juttatási hatás magába foglalja az immuno-enzim konjugátum rögzítését az immunológiai fajlagos- 0 ságnak megfelelő antigénen. Az említett rögzítés elviseli a sejtek mosását és átengedi a felületét bizonyos enzimatikusan aktív ureázoknak, amelyek az immuno-toxinokkal együtt jelenlevő inkubációs tápközegben található karbamidból NH4+ ionokat 45 termelnek, ezáltal előidézik az NH4* ionok érvényre juttató hatását. Az így nyert érvényre juttató hatás egészen hasonló ahhoz, amelyet korábban figyeltek meg, amikor az inkubálás 10 mmól/1 ammónium-klorid je- ^0 lenlétében ment végbe, amely ammónium-kloridot az inkubáló tápközegbe adtuk az immuno-enzim konjugátum/szubsztrátum rendszer helyett. Abban az esetben, amikor ammónium-kloridot adunk, a nyert IC 50 érték 3,8 10 |! mól.l, amint ezt a 2. ábra megfelelő görbéje (8. görbe) mutatja. Az előző példák bemutatták, hogy a találmány szerinti termékek alkalmazhatók a humán gyógyászatban. A találmány szerinti új gyógyszerek injektálható formában szerelhetők ki, az előnyös beadás intravénás úton történik. Ezek bármilyen rákos vagy nem rákos rendellenességek kezelésére használhatók, attól függően, hogy milyen antitestet alkalmazunk az immuno-toxinhoz. Ezek olyan dózisokban és olyan körülmények közt alkalmazandók, amelyeket minden esetben egyedileg kell meghatározni a kezelendő személytől és a rendellenesség természetétől függően. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás immuno-enzim konjugátumok előállítására azzaljellemezve, hogy egy antitestet vagy egy antitestnek egy olyan fragmensél, amely megőrizte az antitestnek a kiválasztott antigént felismerő kapacitását, diszulfid-híd vagy tioéter-kötésekkel kötjük össze egy olyan enzimmel, amely természetes szubsztrátumokból ammónium-ionokat képes termelni. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy egy tiol-funkciót viselő. P,-SH-nak nevezett fehérjét reagáltatunk egy másik, P,-nek nevezett fehérjének olyan származékával, amelybe előzőleg legalább egy olyan csoportot vezettünk be, amely diszulfid-hidat és egy tiol-csoporttal reagálni képes gyököt (X) tartalmaz (X jelentése 2-piridilvagy 4-piridilcsoport), és amelyet ilyen módon P2 - S - S - X-nek nevezünk, és az említett reakciót vizes közegben hajtjuk végre pH 5 és pH 9 értékek közt, 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy egy tiol-funkciót viselő, P,-SH-nak nevezett fehérjét reagáltatunk egy másik, P,-nek nevezett fehérjének olyan származékával, amelybe előzőleg maleimid-gyököt vezettünk be, és amelyet az (1) általános képlettel jellemezhetünk, amely képletben Z jelentése térkitöltő csoportként fenil- vagy naftilcsoport, és az említett reakciót vizes közegben hajtjuk végre, 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten. 3 oldal rajz 8
