189246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy enzim és egy antitest kovalens kötés útján létrehozott új konjugátumainak előállítására
1 189 246 2 az egyes paciensek kezeléséhez meghatározott optimális feltételekkel összhangban. c) A fentebb jelzett körülmények között legalább két, a kívánt hatás eléréséhez szükséges, ható vegyület irányul szelektíven a cél-sejtekre:- egyrészt a ricin A lánca, amely az ún. immunotoxin konjugátumban levő citotoxikus hatóanyag,- másrészt az enzim, amely az érvényre juttató rendszer lényeges komponense, és amelyet az immuno-enzim konjugátum tartalmaz. Ezek a ható vegyületek minden esetben össze vannak kapcsolva - abból a célból, hogy a cél-sejtre irányuljanak és azon szelektíven rögzítve legyenek antitestekkel (vagy antitestek fragmenseivel), amelyek felismerik a cél-sejtek felületén jelenlevő antigéneket. Ha az alkalmazott antitest képes felismerni egy olyan antigént, amely szigorúan fajlagos az elpusztítandó sejtpopulációra, akkor ugyanazt az antitestet lehet használni az összekapcsoláshoz különböző hatóanyagokkal. Legtöbb esetben azonban ajánlatos kiválasztani több különböző antitestet, amelyek különböző antigéneket ismernek fel, amelyeket mind hordoz a cél-sejt. Ez után, még ha mindegyikük nem is szigorúan fajlagos a célsejtekre, teljesen valószínűtlen, hogy a két kiválasztott antigén mindegyike jelen van a cél-sejteken kívül más sejteken; ilyen módon egy rendkívül erőteljes eszköz van a kezünkben az immuno-toxinok citotoxicitása fajlagos jellegének további növelésére. A következő példák a találmány bemutatására szolgálnak és nem korlátozó jellegűek. I. Példa Az immuno-enzim konjugátum egy aktivált diszulfid-híddal szubsztituált anti-dinitrofenil-antitest és egy növényi eredetű ureáz reakciójával készül. a) Anti-dinitrofenil-antitest (Anti-DNP) Ez az antitest monoklonális antitest, amelyet a hagyományos technikával tisztítottunk Balb/C törzsbeli egerek - amelyekbe FQ hibridómát ültettünk be - hasi vízkóros folyadékjából. Magát az említett hibridómát bovin y-globulinnak - amelyen előzőleg 20 DNP gyököt rögzítettünk mólonként - immunizált Balb/C törzsbeli egerek lépsejtjeinek és egér NS 1 mielóma állomány sejtjeinek fúziójával nyerjük. A hibridómát klónozással izoláljuk, hagyományos technikát alkalmazva. Az így nyert antitest G osztályhoz tartozó immuno-globulin, amely a 2 b izotípushoz tartozik, és amelynek affinítási konstansa (e-DNP-lizin ligandumhoz mérve) 1,8-108 (mól/1)“1. b) Aktivált anti-DNP antitest 2 ml, 7,8 mg/ml anti-DNP antitestet (= 0,0104 gmól antitest) tartalmazó oldathoz 1 mg, előzetesen terc-butanolban oldott 3-(pirid-2-il-diszulfanil)-propionsav és 0,6 mg l-etil-3-(dimetil-amino)karbodiimid vizes oldatát adjuk, majd az így kapott elegyet 30 °C-on 15 percen át keverjük és ezután TPE-vel szemben folyamatosan dializáljuk pH 7-nél 40 órán át 500 ml/óra sebességgel. A dialízist követően a proteikus oldatot centrifugáljuk, amikor 2 ml olyan oldatot kapunk, amely 7,2 mg mennyiségben módosított antitestet tartalmaz. 2- merkapto-etanollal végrehajtott cserebomlásos reakcióban felszabaduló piridin-2-tion 343 nm-nél végzett spektrofotometriás meghatározásával megállapítható, hogy az antitest molekulánként 1,2 aktivátor-csoportot tartalmaz. c) Ureáz Az alkalmazott enzim a SIGMA-tól származik (VII. típus, U 0376 referencia-szám), aktivitását 170 egység/mg-nak mértük. Egy egység az enzimnek az a mennyisége, amely karbamidból 1 mikromól NH4+ iont szabadít fel percenként 20 °C hőmérsékleten, pH 7-nél. Az említett enzimnek természetes formájában 27 tiol-csoportja van molekulánként, 480 000 molekulasúlynál. Az említett tiolcsoportok, amelyek ELLMAN módszerével [Anderson, W. L. és Wetlaufer, D. B.: „A new method for disulfide analysis of peptides, Analytical Biochemistry, 67. 493-502 (1975)] mérhetők, nem mind szükségesek az enzimaktivitáshoz. Ezek közül néhány tehát felhasználható az összekapcsoláshoz az aktivált antitesttel. d) Az antitest összekapcsolása az enzimmel 5 mg ureázt feloldunk 0,625 ml aktivált antitestoldatban (7,2 mg/ml 0,125 mól/l-es, 7,0 pH-jú foszfát-pufferben), amely 4,5 mg aktivált antitestnek felel meg. Az oldatot inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten 14 órán át. A reakciókeveréket ez után Sepharose 6 (Pharmacia) géloszlopon, amelyet PBS pufferrel egyenlítettünk ki (PBS puffer foszfátra 10 mmól/1, nátrium-kloridra 14 mmól/1, pH 7,4), kromatografáljuk. A leoldást a 280 nm-nél mért optikai sűrűséggel és az ureáz aktivitásának mérésével ellenőrizzük, az ureáz-aktivitás méréséhez SUMMER módszerét használva (S. B. Colowick és N. O. Kaplan: Methods in Enzymology, II. kötet, 378. oldal, Academic Press kiadás, 1955). A legerősebb ureáz aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítjük, 8 ml 6,5 egység/ml-es konjugátumot nyerünk. Ha az említett oldat egy alikvot frakcióját egy, brómciánnal előzőleg aktivált Sepharose 4 B mátrixon oldhatatlanná tett és hat DNP-gyökkel szubsztituált bovin szérum albuminban abszorbeáljuk, úgy találjuk, hogy az ureáz-aktivitás teljesen abszorbeálódik az oszlopon. Ez is azt mutatja, hogy a konjugátumban jelen levő antitest megőrzi a DNP-haptén felismerő kapacitását, és hogy az ureáz valóban összekapcsolódott az említett antitesttel. 2. Példa Anti-T65 immuno-toxin érvényre juttatása A találmány szerinti, a korábbiak alapján nyert konjugátumot biológiai tulajdonságaira és még inkább az anti-T65 immuno-toxin aktivitást érvényre juttató kapacitására vizsgáljuk egy megfelelő sejtmodellen. Az említett modellt humán limfoblasztoid CEM sejt-állományból (ATCC CCL 119) alakítjuk ki, amely természetes formájában T65 antigént hordoz. Az említett antigén, amely ellen irányul az alkalmazott immuno-toxin, alkotja a modell első 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
