189246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy enzim és egy antitest kovalens kötés útján létrehozott új konjugátumainak előállítására
189 246 2 A jelen találmány egy új konjugátum előállítási eljárásával foglalkozik, amely konjugátumban egy enzim és egy antitest kovalens kötéssel kapcsolódik össze. A találmány szerinti eljárással nyert új termék 5 tehát egy olyan konjugátum, amely valamely enzimet és egy cél-sejt által hordozott antigén ellen irányuló antitestet vagy ennek az antitestnek egy fragmensét kovalens kötéssel összekötve keletkezik. 10 Az igy kapott anyagokat immuno-enzim konjugátumnak nevezhetjük. Ezek az immuno-enzim konjugátumok tehát mesterségesen összekapcsolt kevert molekulák, amelyekben az enzim kovalens kötéssel van össze- 15 kapcsolva egy cél-sejt által hordozott antigén ellen irányuló antitesttel. Az alkalmazott enzimek ismertek. Az alkalmazott antitestek vagy poliklonálisak, ha az állatokon végrehajtott hagyományos immunizálással nyerjük 2 azokat, vagy monoklonálisak, ha limfocita és mielóma sejtek közti fúzióval nyert hibrid-sejtek klónjával termeljük. Az említett antitestet lehet alkalmazni vagy mint teljes immuno-globulin molekulát, amely képes felismerni a kiválasztott antigént, 25 vagy mint ennek az immunoglobulin molekulának bármely olyan fragmensét, amely megőrizte azt a képességét, hogy a kiválasztott antigént felismerje; főleg a F(ab’)2, Fab és Fab’ néven ismert fragmensekről van szó. Az antitestnek (vagy az antitest fragmensének) összekapcsolását az enzimmel többféle módszer szerint is végre lehet hajtani, feltéve, hogy a kiválasztott módszer- megőrzi a konjugátum mindkét komponensé- 35 nek: az antitestnek és az enzimnek a biológiai aktivitását, biztosítja az eljárás kielégítő reprodukálhatóságát és a jó kitermelést a kapcsolási folyamatban,- lehetővé teszi az enzim/antitest arány értékének 40 szabályozását a kapott konjugátumban és végül- stabil és vízoidható terméket nyújt. Azok között a módszerek között, amelyek kielégítik a fenti követelményeket, a legelőnyösebbek azok, amelyek egy vagy több tiol-funkciót használ- 45 nak a két fehérje közti kapcsolat létrehozásához. Az említett tiol-funkciók szempontjából közömbös, hogy ezek az összekapcsolandó fehérjék valamelyikéhez tartoznak, vagy mesterségesen vezetjük be azokat egyik vagy másik fehérjébe, amely erede- 50 tileg nem tartalmaz tiol-csoportot. Ha egy vagy több tiol-csoportot kell mesterségesen bevezetni a fehérjébe, ezt végrehajthatjuk a szóbanforgó fehérje és a fehérje néhány aminocsoportját acilezni képes 5-acetil-merkapto-boros- 55 tyánkösav-anhidrid reakciójával. A tiol-csoportot azután fel lehet szabadítani az acetil-védőcsoport eltávolításával, amelyet hidroxil-aminnal végezhetünk el, amint ez az „ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND. BIOPHYSICS” 119, 41-49 (1967) 60 irodalmi helyen olvasható. Dialízissel hajtható végre a reagensek feleslegének, valamint a kis molekulasúlyú reakciótermékeknek az eltávolítása. Más módszerek is ismeretesek az irodalomban a tiolfunkciók bevezetésére az összekapcsolandó fehérjék valamelyikébe. A találmány szerint a két fehérje egyikét, amely egyedül rendelkezik tiol funkcióval, reagáltatjuk a másik fehérjével, amelybe előzőleg bevezettünk egy vagy több olyan funkciót, amely képes reagáltatni tiolokkal. A reakciót vizes közegben végezzük, 5 és 9 pH értékek közt, 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten, így jutunk stabil, specifikus kovalens kötéshez. Az említett kovalens kötés főleg diszulfidhíd, vagy tioéter-kötés. P,-nek nevezzük ezután a két fehérje közül azt, amely a tiol-funkciót vagy funkciókat hordozza és P2-nek nevezzük a másik, kapcsolandó fehérjét. 1. Diszulfid-híd A konjugátum képződését a következő reakcióvázlattal szemléltethetjük: P, —SH + P2 —S-S-X-P.-S-S —P2 + XSH ahol -S-S-X aktivált kevert diszulfidot jelent, ahol az X csoport az aktivátor-gyök, és jelentése 2-piridil- vagy 4-piridilcsoport. Az aktivált kénatommal helyettesített P2 fehérjét a P2 fehérjéből lehet nyerni, egy olyan reagens segítségével végzett helyettesítéssel, amely reagens az aktivált kénatomot hordozza. A folyamatot az alábbi reakcióvázlat szemlélteti p2 + y-r-s-s-x-p2-r-s-s-x ahol P2 a szubsztituálandó fehérje, Y a reagensnek a fehérjéhez történő kovalens kötését lehetővé tevő csoport, R olyan csoport, amely egyszerre hordozhatja az Y szubsztituenst és az - S - S X szubsztituenst X az aktivátor-gyök. Az Y funkciós csoport olyan csoport, amely képes kovalens kötést létesíteni a szubsztituálandó fehérjét alkotó aminosavak oldalláncain hordozott valamelyik csoporttal. Ezek közül a fehérjében levő lizil-gyök terminális aminocsoportja különösen javasolt. Ebben az esetben Y főleg a következő csoportokat jelentheti:- karboxil-csoportot, amely a fehérje aminocsoportjaival kötést létesíthet egy kötő-ágens, mint pl. karbodiimid, és főleg ennek egy vízoldható származéka, mint pl. I-etil-3-(3-dietil-amino-propil) karbodiimid jelenlétében,- karbonsav-kloridot, amely közvetlenül képes reagálni az amino-csoporlokkal, acilezve azokat,- úgynevezett „aktivált” észtert, mint pl. egy orto- vagy para-, nitro- vagy dinitro-fenil észtert, vagy egy N-hidroxi-szukcinimid-észtert, amely közvetlenül képes reagálni az aminocsoportokkal. acilezve azokat,- két karboxil-csoporttal rendelkező savak belső anhidridjeit, mint pl. borostyánkösav-anhidridet, amely spontán reagál az amino-csoportokkal, amid-kötést képezve, ^NH- imido-észter csoportot ( — C^q^ , ahol R, alkil-csoport), amely a fehérje amino-csoportjával a következő reakcióvázlat szerint reagál: Fehérje—NH,+ C - - Rj •NH-►Fehérje—NH - C —R,+ R,OH 2
