189204. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátészter és sói előállítására
1 .189 204 2 don szulfátésztert képezünk belőle, majd nátriumhidroxiddal reagáltatva a nátrium-sót kinyerjük. Termelés 1,5 g (50%) fluorenil-metil-oxi-karbonil-O-szulfáto-L-tirozil-terc-butil-oxi-karbonil-hidra- 5 zid-nátriumsó. 1.0 g-ot a kapott anyagból 0 °C-on 4 ml trifluorecetsavban oldunk, az oldatot 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A végterméket száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük, éterrel mossuk. Termelés 0,9 g (90%) fluorenil-metil-oxi-karbonil-O-szulfáto-L-tirozin-hidrazid-trifluoracetát-nátriumsó. 620 mg-ot (1 mmól) a nyert termékből 2 ml dimetil-formamidban oldunk, az oldatot — 15 °C-ra hűtjük és keverés közben 250 pl 5 mólos nátriumnitrit-oldatot és 200 pl cc. sósavat adunk hozzá. Tizenöt perc eltelte után 400 pl trietil-aminnal semlegesítjük és 540 mg (0,6 mmól) L-metionil-glicil-L- triptofil-L-metionil-L-aszparaginil-L-fenilalaninamid-trifluoracetátot adunk hozzá 2 ml dimetil- 2Q formamidban oldva. A reakcióelegyet egy éjjel állni í hagyjuk, a pH-t 7,0-n tartjuk trietil-amin adagolással. Az oldatot pH = 6,0-n bepároljuk, a maradékot 20 ml 1 n sósav-oldattal eldörzsöljük. A kapott amorf port szűrjük, vízzel, éterrel mossuk, majd 20 ml dimetil-formamidban feloldva a pH-t 7,0-re 25 állítjuk 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és bepároljuk. A kapott 600 mg (80%) védett fluorenil-metil-oxi-karbonil-O-szulfáto-L-tirozil-L- metionil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L-aszparaginil-L-fenilalanin-amid-nátriumsót további tisztítás 3 nélkül alkalmazzuk. 500 mg (0,4 mmól) védett heptapeptid-szulfátészter-nátriumsót 3 ml dimetil-formamidban oldunk. Hozzáadunk 400 pl piperidint, az oldatot 10 . percig állni hagyjuk, majd ecetsavval semlegesítjük, 5 majd bepároljuk. A maradékot 5 ml n sósav-oldattal 0 °C-on amorf porrá dörzsöljük. A kapott anyagot 5 ml dimetil-formamidban feloldva az oldat pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,5-re állítjuk, majd bepároljuk. A végterméket etil-acetáttal eldörzsöl- 40 jük, szűrjük. 380 mg (92%) O-szuIfáto-L-tirozil-L- metionil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L-aszparaginil-L-fenilalanin-amid-nátriumsót kapunk. 2.1 g (5 mmól) fluorenil-metil-oxi-karbonil-L- aszparaginsav-P-terc-butíl-észtert 5 ml kloroform- 45 ban oldunk, lehűtjük — 15°C-ra, hozzáadunk 550 pl N-metil-morfolint és 650 pl klór-hangyasavizobutil-észtert. 10 perc keverés után 5 ml kloroformban oldott 0,65 g (5 mmól) terc-butil-oxikarbonil-hidrazidot adunk hozzá. Egy órán át 50 0 °C-on keverjük, egy éjjel állni hagyjuk, majd bepároljuk. A maradékot etil-acetátban feloldva kálium-hidrogén-szulfát és kálium-hidrogén-karbonátoldattal extraháljuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton megszárítjuk. A kapott anyagot 0 °C-on 5 ml 55 trifluor-ecetsavban feloldjuk, oldódás után 45 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd éterrel kicsapjuk. A kivált kristályokat szűrjük és éterrel mossuk. A termék 1,2 g (50%) fluorenil-metil-oxikarbonil-L-aszparaginsav-a-hidrazid-trifluorace- 60 tát. 240 mg (0,5 mmól) fluorenil-metil-oxi-karbonil- L-aszparaginsav-a-hidrazid-trifluoracetátot 2 ml dimetil-formamidban oldunk, — 15 °C-ra hűtjük és 125 pl 5 mólos nátrium-nitrit-oldatot és 100 ml cc. sósavat adunk hozzá. 15 perc keverés után 200 pl trietil-aminnal semlegesíjük, majd 300 mg (0,3 mmól) O-szulfáto-L-tirozil-L-metionil-glicil- L-triptofil-L-metionil-L-aszparaginil-L-fenilalaninamid-nátriumsót adunk hozzá 2 ml dimetil-formamidban oldva. Az oldat pH-ját trietil-aminnal 7,0- en tartjuk, egy napig szobahőmérsékleten keverjük, majd az 1. példával analóg módon feldolgozzuk, így 250 mg (71%) L-aszparaginil-O-szulfáto-L-tirozil-L-metionil-glicil-L-triptofil-L-metionil-L- aszparaginil-L-fenilalanin-amid (I) oktapeptidszulfátésztert kapunk. Szabadalmi igénypontok Eljárás az (I) általános képletű L-Asp-L-Tyr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phc — N H 2( I ) so3x kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátészterek előállítására, ahol a képletben X hidrogénatomot vagy alkálifémiont jelent, azzal jellemezve, hogy a) a (II) képletű hexapeptidet L-Met-Gly-L-T rp-L-Met-L-Asp- L-Phe—N H 2 (II) (III) általános képletű védett dipeptid-hidrazidból Y-L Asp-L-Tyr—N2H3 (III) so3x- a képletben X jelentése a fenti és Y lúggal lehasítható, savra azonban rezisztens, ismert védőcsoportot, célszerűen fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoportot jelent - képezett aziddal reagáltatjuk, vagy b) a (II) képletű hexapeptidet adott esetben aktivált karboxilcsoportot tartalmazó Y-O-szulfáto-LTyr-al vagy alkálifémsójával - a képletben Y jelentése a fenti - reagáltatjuk, a kapott termék Y védőcsoportját lehasítjuk, majd a képződött (V) általános képletű heptapeptidet L-Tyr-L-Met-Gly-L-T rp-L-Met-L-Asp-L-Phc—NH 2 (V) so3x - a képletben X jelentése a fenti - lúggal lehasítható, savra azonban rezisztens védőcsoporttal, célszerűen fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoporttal védett aszparaginsavval reagáltatjuk, végül az a) vagy b) eljárás szerint kapott (IV) általános képletű védett oktapeptid-származék Y-L-Asp-I/Tyr-l^Met-Gly-L-T rp-L-Met-l^Asp-L^Phc—N H2 so3x (IV) - a képletben X és Y jelentése a fenti - Y védőcsoportját lehasítjuk, és a képződött (I) általános képletű kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátésztert sav (X = hidrogénatom) vagy só (X = alkálifémion) formájában elkülönítjük. Ábra nélkül 5
