188953. lajstromszámú szabadalom • Reagens glükóz, koleszterin-, húgysav, hemoglobin meghatározásához
1 188953 2 2. Referens módszerhez való hasonlítás tapasztalatai: Referens módszerként a nemzetközileg elfogadott Boehringer-féle hexokinázos UV tesztet használtuk. Cukortartalmú oldatként ez esetben (45 5 db, válogatás nélküli) emberi vérmintát alkalmaztunk A 2. ábra azt mutatja, hogy nincs eltérés a két módszerrel kapott eredmények között, hiszen a korrelációs koefficiens (r=-+0,9971 jól megközelíti az elméletileg elérhető 1,000-et, a regressziós 10 egyenes meredeksége pedig 0,4%-kal tér csak el az ideális 1,000-től. 3. Mérési adatainkból meghatároztuk az eljárás érzékenységét, reprodukáltságát és a torzítását is. Ezek a statisztikai számítások az alábbi eredmé- 15 nyékét adták: Érzékenység: ±0,17 mmól/1 (cukorra vonatkoztatva) Pontosság: ±0,18 mmól/1 (cukorra vonatkoztatva) 20 Torzítás: ±0,35% (cukorra vonatkoztatva). Találmányunk szerinti reagens a fentieken túl még olyan jelentős előnnyel is rendelkezik, hogyi alkalmas egyrészt az emberi és állati eredetű bio-j lógiai mintákban (vér, vizelet, likvor) található 25 glükóz, koleszterin és húgysav koncentrációk mennyiségi mérésére, másrészt a glükóz (szőlőcukor) meghatározására emberi fogyasztásra alkalmas italokból (szeszes italok, szörpök, üdítő italok) illetőleg más, glükóz, vagy koleszterin, vagy 30 húgysav tartalmú oldatok mérésére is. Kiemelésre kívánkozik az is, hogy reagensünk lényeges előnyt mutat az ismert tesztekkel szemben is. Számszerűen ez annyit jelent, hogy míg a saját módszerünk színe legalább 240 percig 35 teljesen változatlan, az ismert módszereknél egy rövid maximum után (45 perc múlva) folyamatosan csökkenő színintenzitást mutat. A találmány szerinti reagenst, illetve annak mérésében való felhasználását az alábbi példákon 40 mutatjuk be: 1. példa: Glükóz meghatározás vérszérumból a-oldat: 0,1 móJ/liter foszfát puffer-oldatban, ahol pH = 7,5 (Na2, HP04-2H20 és KH2P04) a következő anyagokat oldjuk: 45 glükóz-oxidáz: 10U/ml,' peroxidáz: 18U/ml, 4-amino-fenazon: 1,0 mmól/1, nátriumazid: 12,3 mmól/1. b-oldat: 12,5 mmól/1 timol 96%-os desztillált 50 etilalkoholban. Munkareagens: az a és b oldatot felhasználás előtt 4:1 arányban elkeveqük. Standardírozás: 11,1 mmól/1 töménységű (hidegen telített benzoésavban oldott) glükóz- 55 oldattal. Meghatározás: kémcsövekbe, 3,0-3,0 ml munkareagenshez 0,02 ml standardot, illetve a további csövekbe 0,02 ml vérszérumot mérünk. Az anyagokat elkeverjük, majd állni hagyjuk. 60 (Szobahőmérsékleten 30 percig, vagy 37 °C-on 15 percig.) Az utóbbi esetben 10 perc lehűlés után a keletkező színt vakpróbával összehasonlítva fotometriásan méijük, 1 cm-es küvettavastagságnál 483 mm hullámhosszon. Számítás: Vérszérum glükóz mmöl/1 koncentráció = —XI 1,1 Minta extinkció Standard extinkció Az eljárás 0—30 mmól/1 tartományban lineáris. 2. példa: összkoleszterin meghatározás vérszérumból ____ a) óidat: 0,1 móí/l-es, pH 7,5-ös foszfát-pufferben a következő anyagokat oldjuk fel: peroxidáz: 18U/ml, koleszterinészteráz: 12,5U/mk koleszterinoxigáz- 6 U/ml, 4-aminofenazon. 1,0 mmól/1, nátriumazid 12,3 mmól/1, 9-lauriléter: .5,0 g/1 vagy Triton X—100: 5 m/1, vagy Brij-35: 5 g/1. b) oldat: 12,5 mmól/1 timol, 96%-os redesztillált etilakoholban. Munkareagens: az a és b oldatot felhasználás előtt 4:1 arányban elkeverjük. Standardirozás: 5,2 mmól/1 etilakoholban oldott koleszterin standard. Meghatározás: 2,0—2,0 ml munkareagenshez 0,02 ml standard oldatot, illetve szérumot adunk. Elkeveqük, majd állni hagyjuk, vagy szobahőmérsékleten 30 percig, vagy 37 °C-on 15 percig. 10 perc hűlés után a keletkező színt vakpróbával összehasonlítva fotometriásan méqük 1 cm-es küvettavastagságnál 483 mm hullámhosszon. Számítás: Vérszérum-koleszterin (mmól/1) koncentráció = Minta extinkció X5,2 Standard extinkció Az eljárás 0-13 mmól/1 tartományban lineáris. 3. példa: Húgysav meghatározás vérszérumból a) oldat: 0,1 mól/l-es pH 7,5-ös foszfát-pufferben a következő anyagokat oldjuk: peroxidáz: 18Uml, urikáz: 6 U/ml, 4-aminofenazon. 1,0 mmól/1, nátrium-azid: 12,3 mmól/1. b) oldat: 12,5 mmól/1 timol 96%-os etilalkoholban. Munkareagens: a és b oldat 4:1 arányú keveréke. Standardírozás: 595 pmól/l húgysav standarddal. Meghatározás: 2,0—2,0 ml reagenshez 0,2 ml standard, vagy szérum mintát mérünk. Elkeverjük, majd vagy szobahőmérsékleten 60 percig, vagy 37 °C-on 30 percig állni hagyjuk. Fotometria: 1 cm-es küvettában, 483 mm-en a keletkező színt vakpróbával összehasonlítva fotometriásan méijük. 4
