188953. lajstromszámú szabadalom • Reagens glükóz, koleszterin-, húgysav, hemoglobin meghatározásához
1 188953 2 Atalálmány tárgya új reagens glükóz, koleszterin és húgysav előnyösen biológiai mintákban történő meghatározására. A glükóz, a koleszterin és a húgysav kimutatására és mennyiségi meghatározására számos eljárás ismert, azonban a legelteijedtebbek a kémiai színreakción alapuló módszerek, könnyű kivitelezésük, olcsóságuk és méréstechnikai okok miatt. Leggyakoribban az l-fenil-2,3-dimetil-3-aminopirazolin-5-on (a továbbiakban röviden: 4-aminofenazon) fenollal, fenolszármazékokkal, valamint szalacilsav-származékokkal képzett színreakcióját használják a fenti anyagok mérésére. A fenol 4- amino-fenazonnal végbemenő reakcióját P. Trinder (Ann. Clin. Biochem. 6, 24 (1969)) alkalmazta először vércukor meghatározására. Ennek a metodikának az orvosi jelentősége olyan nagy, hogy számtalan hasonló módszert dolgoztak ki erre a célra. Ezek általános hibája az, hogy mérési karakterisztikájuk nem lineáris, a keletkezett szín nem kellően stabil, illetve fényérzékeny. (Lásd: a fenti közlemény 1. sz. táblázata, illetve 3. sz. ábránk). Felvetődött tehát a szükségessége egy, ezen hátrányokkal nem rendelkező új módszer kidolgozásának. Vizsgálataink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy ha a színes termék képzéséhez a 4-amino-fenazont és a timolt választjuk, akkor az optimális feltételek kidolgozása esetén egy kitűnő, jól használható (stabil, nem fényérzékeny, lineáris karakterisztikájú) fotometriás reakciót hozhatunk létre, melynek érzékenysége is igen jó. A szakirodalomból (Pharmazie 29, 424(1974)) ismert, hogy a 4-amino-fenazon kálium-ferricianid oxidálószer jelenlétében fenollal és különböző fenol-származékokkal, köztük timollal is színreakciót ad. Ezt a színreakciót a szerzők különféle drogok, gyógyszerkészítmények és vegyi anyagok fenol-tartalmának kimutatására használták fel. Minthogy az idézett közlemény szerint a timol nem mérő reagensként, hanem kimutatandó anyagként szerepelt, nyilvánvaló, hogy a szerzők a timol optimális koncentrációjával, a képződött színes termék abszorpciós tulajdonságaival, a mérési karakterisztika linearitásával egyáltalán nem foglalkoztak. Nem vizsgálták a szerzők a timol és az oxigén felszabadítására adott esetben felhasznált enzimek kompatibilitási viszonyait sem. Az idézett közleményből csupán annyi állapítható meg, hogy 4-amino-fenazon és timol oxidálószer jelenlétében végrehajtott reakciója során színes tennék képződik, ennek analitikai hasznosításáról azonban semmiféle következtetés nem vonható h' A találmány tárgya tehát reagens glükóz, koleszterin és húgysav előnyösen biológiai mintákban történő meghatározására, amely 4-amino.2 fenazont, ismert pufferoldatot, ismert stabilizálószert, ismert detergenst, adott esetben enzimkatalizátort tartalmaz. A találmány szerinti reagens reaktánsként timolt (para-izopropil-metakrezolt) tartalmaz, 2,30—2,70 mmól/liter, előnyösen 2,5 mmól/liter koncentrációban. A találmány szerinti reagens egyik előnyös kiviteli alakjánál a timolt rövidszén láncú alkanolban, célszerűen etanolban, a többi kémiai anyagot pedig desztillált vízben oldjuk fel, és az alkoholos és vizes oldatot felhasználás előtt 1:4 arányban elkeverjük. így a reagens a timolt 2,5±0,2 mmól/liter koncentrációban tartalmazza. Az egyéb kémiai anyagok koncentrációja a reagensben: Foszfát-puffer 0,08 ±0,02 mól/1 4-Aminó-fenazon 0,8 ±0,2 mmól/1 Nátrium-azid 12,3±0,1 mmól/1 Etanol 3300± 1000 mmól/1 A találmány szerinti reagens használatakor úgy járunk el, hogy a timolt és a 4-amino-fenazont alkalmas koncentrációkban, megfelelő pufferes közegben összehozzuk a vizsgálni kívánt anyagokkal (glükóz, koleszterin, húgysav), amelyek specifikus cnzimatikus reakciókkal hidrogén- peroxid képződését eredményezik. Ebből peroxidázzal naszcensz oxigént szabadítunk fel, ami létrehozza a 4-(2’-izopropil-5,-metil-l', 4’-benzokinonmono-imino)-fenazont, a színes terméket. Olyan anyagok esetében, amelyek önmaguk katalizálják a hidrogén-peroxid bomlását (például: hemoglobin), enzimes kiegészítő reakcióra nincs szükség, csak a hidrogén-peroxid, valamint a színképző 4-amino-fenazon és a timol kerül a reakcióelegybe. A találmány szerinti új reagens használatának több előnye van. Ezeket az alábbiakban foglaljuk össze: a) A színreakció kialakulása jól definiált pH tartományban: pH 7,0—pH 8,0 optimálisan pH = 7,5 értéknél biztosított. b) A kialakult színes termék fényelnyelésének maximuma a 475—490 mm hullámhosszak közé esik, ezért ebben a tartományban célszerű a fotometriás méréseket végezni, optimálisan 483 mm-nél. c) Lényeges, hogy a fotometrálható szín kialakulása aránylag gyors. Megállapítottuk, hogy szobahőfokon 25 perc, míg 37 °C-on 15 perc alatt kialakul a stabil szín. d) Az optimális pH érték beállításához, többféle puffer jöhet szóba: tris-foszfát, dinátriumhidrogén-foszfát - kálium-hidrogén-foszfát, dikálium-hidrogén-foszfát — kálium-dihidrogén-foszfát, és nátrium-borát - sósav. e) Sikerült megállapítanunk a legmegfelelőbb timol koncentrációt, illetve annak oldószerét is. A timol számára a legcélszerűbb oldószerként a metil-, etil-, izopropil-alkohol közül az etil-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
