188709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cedfalosporin-metilészterek enzimes dezészterezésére
1 1S8 709 2 H élesztőkivonat 5 g magnézium-szulfát • 7 H20 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 2 g kalcium-karbonát 1 g glükóz 10 g Czapek oldata 2 ml víz 1000 ml-re kiegészítve. 250 ml térfogatú lombikokba 50 ml-t töltünk, mindegyik táptalajból, majd sterilizáljuk, lehűtjük és a 3. példában megadottak szerint beoltjuk és inkubáljuk. Az egyes táptalajokkal készített tenyészetekből vett mintákat a 3. példában megadottak szerint szubsztrát vegyülettel reagáltatjuk. A reakcióeiegyeket papír-kromatográfiásan analizálva azt találtuk, hogy az A, C, D, E és F táptalajokon az enzim termelése gyenge. A nagyméretű gátlási zóna jelentkezése alapján az enzim a B, G és H táptalajokban jelent meg. 5. példa Vizsgáljuk néhány aminosav hatását a mikroorganizmus növekedésére és az enzim termelésére. Nagymennyiségű, alábbi összetételű alap-táptalajt készítünk: magnézium-szulfát • 7 H20 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 2 g kalcium-karbonát 1 g Czapek oldata 2 ml víz 1000 ml-re kiegészítve. A fenti táptalajt részekre osztjuk, és mindegyikhez egy aminosavat adunk, literenként 2 g-ot. Az alábbi aminosavakat vizsgáljuk: 1) L-glutaminsav 2) L-alanin 3) L-arginin 4) L-aszparaginsav 5) L-glicín 6) L-hisztidin-hidrogén-klorid 7) L-prolin 8) L-szerin 9) L-treonin. Mindegyik táptalajhoz literenként 10 g steril glükózt adunk, sterilizálás után. 50 — 50 ml táptalajokat 250 ml térfogatú lombikokba töltünk, és az előző példákban megadottak szerint beoltjuk és tenyésztjük. A 41. és 65. órában mindegyik tenyészetből mintát veszünk, és az előzőekben ismertetett korong-módszerrel meghatározzuk észter-hasítási aktivitásukat. A következő táblázatban megadjuk a mintavétel idején mért pH-értékeket, az enzim specifikus aktivitását (mól x 10~'° észter hidrolizálva/mg száraz sejt • perc). I. táblázat Táp-PH Specifikus aktivitás 41 óra 65 óra 41 óra 65 óra 1 7,5 7,3 3,7 3,2 2 7,4 6,1 1,8 3,2 3 6,8 6,7 3,1 1,6 4 7,9 7,1 3,4 4,7 5 7,3 6,8 4,3 3,8 6 7,4 6,6 2,2 10,2 7 6,8 6,6 5,0 0,8 8 7,2 6,6 5,0 5,7 9 6,8 6,5 8,2 5,7 6. példa További kísérletet végzünk néhány aminosavval az enzimtermelésre nézve optimális táptalaj meghatározására. A kísérlet során az alábbi összetételű alaptáptalajt használjuk: magnézium-szulfát ■ 7 H20 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 2 g kalcium-karbonát 1 g glükóz 10 g Czapek oldata 2 ml víz 1000 ml-re kiegészítve. Az alaptáptalajt elosztjuk és literenként 2 g, az előzőekben megadott aminosavat adunk hozzá. A táptalajok pH-ját 7,0-ra állítjuk be, majd sterilezzük, és az előzőekben megadott módon, a mikroorganizmus vegetativ tenyészetével beoltjuk és inkubáljuk. 44 órás tenyésztést követően mindegyik fermentléből 4 ml mintát veszünk, és 1 ml, 0,5 mólos dikálium-hidrogén-foszfát pufferrel készült (pH = 7,0), 5 mg/ml koncentrációjú metil - 7 - aminő - 3 - metil - 3 - cefém - 4 - karboxilát - oldattal keverjük. A szubsztrát-oldat a sejtek növekedésének gátlására 20 pg/ml nátrium-azidot is tartalmaz. 5 órán át 30 °C hőmérsékleten keverjük a reakcióelegyeket, majd korong-módszerrel vizsgáljuk eszleráz-aktivitásukat. Az eszteráz-aktivitásokat a II. táblázatban adjuk meg. II. táblázat Specifikus aktivitás i) arginin 24 2) hisztídin 5,1 3) izoleucin 9,0 4) leucin 10 5) lizin 9,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
