188709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cedfalosporin-metilészterek enzimes dezészterezésére
1 188 709 2 gén-foszfát-puffereket használunk. Ezeknek a puffereknek bizonyos pH-értékük van. A pulferekel úgy állítjuk elő, hogy kálium-dihidrogén-foszfátoldatokat készítünk, és a kívánt pH-értéket kálium-hidroxiddal vagy foszforsavval állítjuk be. A fermentációs táptalajokat rutinszerűen, gőzzel sterilizáljuk. A glükózt és az ammónium-sókat, használatuk esetén, sterilizálást követően adagoljuk, és vizes oldatként szűrővel sterilizáljuk. 10 1. példa Az enzim előállítására a S. capillispira A49492 jelű tenyészetével vegetatív inokulumot indítunk 2515 ml, alábbi összetételű táptalajban: glükóz kukoricakeményítő folyékony húspepton enzimesen hidrolizált kazein melasz magnézium-szulfát • 7 H20 kalcium-karbonát Czapek sóoldat* *A Czapek-oldat összetétele: kálium-klorid magnézium-szulfát • 7 H20 vas-szulfát ■ 7 H,0 tömény hidrogén-klorid 20 25 g/liter 10 g/liter 10 g/liter 4 g/liter 5 g/liter 0,5 g/liter g/üter 25 2 ml/liter előállítására az S. capillispira ferdeagar tenyészetével 250 ml táptalajt oltunk, majd ezt a tenyészetet 2 napon át 30 °C hőmérsékleten rázzuk. Előállítjuk a föfermentációs táptalajt: ehhez 3 ml szilikon habzásgátlót adunk és pH-ját 6,7-re állítjuk be. A táptalajt tartalmazó fermentort 1 órán át 121 °C hőmérsékleten (1,05 kg/cm2) sterilizáljuk. Ezután lehűtjük a fermentort és a táptalajt, hozzáadjuk az inokulumot, majd elindítjuk a keverőt és a levegőáramot. A bevezetett levegő mennyisége az egész fermentáció során 5 liter/perc; a fermentlé hőmérséklete pedig 30 °C. 107 órán át végezzük a tenyésztést. A fermentlé pH-ját időnként megmérjük, a fermentáció során emelkedik. A 17., a 89., a 99. és a 101. órában foszforsav adagolásával 6,7-re állítjuk vissza a pH-t. A tenyészetből a tenyésztés kezdetekor és minden nap mintát veszünk, a mintákat lefagyasztjuk és enzimaktivitás mérésére félretesszük. A fermentáció végén felolvasztjuk a mintákat, centrifugáljuk, majd az 1. példában megadott szubsztrátot adjuk hozzá. 16 órás reakciót követően papírkromatográfiával vizsgáljuk azokat. A legmagasabb észter-hasítási aktivitást a fermentáció 67. órájában vett mintában találjuk. Az aktivitás a 41. órában jelenik meg, a 67. órát követően pedig a maximális aktivitásnál alacsonyabb aktivitást mértünk. 100 g/liter 30 100 g/liter 2 g/liter 2 ml/liler. A beoltott tenyészetet 3 napon át 30 °C hőmér- 35 sékleten rázzuk, majd 4 ml tenyészetet átpipetlázunk egy 50 ml térfogatú lombikba. Ehhez, a lombikhoz I ml, szűrővel sterilizált, ml-enként 5 mg metil - 7 - amino - 3 - metil - 3 - cefém - 4 - karboxilátot tartalmazó, 7,0 pH-jú szubszlrát olda- 40 tot adunk. Az oldatot rázás közben 30 °C hőmérsékleten, 16 — 20 órán át inkubáljuk, amialatt az enzim észter-hasítja a szubsztrát vegyületet. A reakcióidő letelte után centrifugáljuk a tényé-45 szetet, ekkor pH-ja 6,4. A felülúszót az előzőekben megadottak szerint papír-kromaíográfiásan vizsgáljuk, a futtatást acetonitril és víz 4 : 1 arányú elegyével végezzük. A kromatográfiás papírra acilezőszert szórunk, acilezőszerként petroléterben oldott fenoxi-acetil-kloridot használunk. Ezután B. subtilis mikroorganizmussal beoltott agarlemezre helyezzük a kromatografáló papírt, majd inkubációt követően gátlási zónát találunk. Gátlási zónát nem figyelhetünk meg észter-hasítást katalizáló enzimet nem termelő mikroorganizmussal. 2. példa 3. példa Kísérleteket végzünk néhány komplex, és kémiailag meghatározott összetételű táptalajjal, annak megállapítására, hogy a mikroorganizmus növekedése és az észter-hasítást katalizáló enzim termelése hogyan változik. Az alábbi táptalajokat használjuk: glükóz 15 g szójababdara 15 g kukoricalekvár 10 g tápiókadextrin 20 g kalcium-karbonát 2 g Czapek oldata 2 ml víz 1000 ml-re kiegészít A táptalaj pH-ját 6,8-re állítjuk be. 55 B 60 Az 1. példában megadott táptalajon tenyésztjük a mikroorganizmust; a tenyésztést azonban 10 literes keverővei felszerelt fermentorban végezzük; a táptalajon át pedig levegőt vezetünk. Az inokulum g5 glükóz melasz pepton kalcium-karbonát Czapek oldata víz A táptalaj pH-ját 7,0-ra állítjuk be. 10 g 20 g 5 g 2 g 2 ml 1000 ml-re kiegészítve. 7
