188709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cedfalosporin-metilészterek enzimes dezészterezésére
1 188 709 2 A táptalaj pH-ját 6 és 8 között, çlônyôsen 6,5 és 7,5 között, még előnyösebben 6,9 és 7,1 között kell tartanunk. Úgy találtuk, hogy a növekedés előrehaladtával a tenyészet pH-ja általában csökken; így a pH-t bázis adagolásával növelnünk kell. A pH adott szinten tartását előnyösen automatikus szabályozásával biztosítjuk. Különösen előnyös eljárást jelent az, ha a pH beállítását nitrogénforrás adagolásával kötjük egybe oly módon, hogy a pH-t amniónium-hidroxid-oldattal szabályozzuk. Az A49492 jelű mikroorganizmus növekedéséhez levegőt igényel. Előnyösen úgy járunk el, hogy kisméretű tenyészeteket rázott lombikban levegőztetünk, nagy méretekben pedig süllyesztett, levegőztetett tenyésztést alkalmazunk. A mikroorganizmus természetesen bő ferde-agarokon és agarlemezeken is. Lehetséges a főfermentációt közvetlenül spóraszuszpenzióval oltanunk; előnyösen azonban vegetatív inolculumot használunk. A vegetatív inokolum előállítására kismennyiségű táptalajt oltunk a mikroorganizmus spóráival vagy micélium fragmenseivel, amikor aktívan növekvő tenyészetet kapunk. A vegetatív inokulumot használjuk azután a nagytérfogatú fermentációs táptalaj oltására. Az A49492 jelű mikroorganizmus 25 °C és 40 °C között jól növekszik. Előnyös azonban, hogy a mikroorganizmust 30 °C és 37 °C között tenyésztjük. Az A49492 tenyészetben az enzim különböző időpontokban jelenik meg, általában azonban a 2-7. nap között mérhetünk jó enzimtermelést. Használhatunk hosszabb fermentációs időt is, a szükségtelennél hosszabb növesztési periódusokkor azonban gyakran csökken az enzim hozama. Ha az enzimet az A49492 törzs tenyésztésével állítottuk elő, úgy járhatunk el, hogy az átalakítandó szubsztrátot hozzáadjuk a fermenllchez; eljárhatunk azonban oly módon is, hogy az enzimet elkülönítjük és tisztítjuk, majd ezután használjuk fel. Az aíábbi példákban szemléltetjük azt az eljárást, amikor a szubsztrátot egyszerűen hozzáadjuk a fermentléhez. A találmány egy másik előnyös kivitelezési változata szerint, gyakran hatásosabb, ha az enzimet elkülönítjük a tenyészetből és részlegesen tisztított alakban használjuk. Az enzim a fértmentlében a sejtekkel együtt van jelen. Ily módon a tenyészetből el kell különítenünk a sejteket, és a sejtekből az enzimet. A sejtek feltárását homogenizálással, ultrahangos kezeléssel, a sejtek lizozimes lízisével, fagyasztással és a fagyasztott massza roncsolásával érjük el. A sejtek feltárásához előnyösen ultrahangos kezelést használunk. Az enzimet a feltárt sejtekből úgy izoláljuk, hogy a sejthomogenizátumot semleges vagy közel semleges pufferben szuszpendáljuk, a szuszpenziót szűrjük vagy centrifugáljuk a sejttörmelékek eltávolítására. A kapott enzim-oldatct felhasználhatjuk a találmány szerinti eljárás során, de tovább tisztíthatjuk vagy töményíthetjük. Az enzim tisztítására az enzimet tartalmazó oldatot oszlop-kromatográfiásan kezeljük, ekkor a különböző, oldatban lévő fehérjék elkülönülnek. A tisztított enzimei tovább töményítheljük, ha ez szükséges, például ultraszűréssel. Az enzim magasabb hőmérsékleten gyorsan bomlik, így előnyösen viszonylag alacsony hőmérsékleten, példáyl 0 °C-on tároljuk. A találmány szerinti eljárás reakciójának analízisét bioautográfiával követjük, végezhetünk papírvagy vékonyréteg-kromatográfiát is. A vizsgálat során felhasználjuk azt a tényt, hogy a szubsztrátészterek viszonylag inaktív antibiotikumok, míg a találmány szerinti eljárás során keletkező cefalospor in-savak aktívak. Például úgy járunk el, hogy a reakcióelcgyet vékonyréteg-kromatográfiás lemezen vagy szűrőpapíron futtatjuk, a futtatást megfelelő oldószerrel végezve. Ezután megfelelő mikroorganizmussal beoltott agar-tartalmú táptalajra helyezzük a kromatogramot. A kipmatogramon lévő cefalosporinsav mennyiségét az adott kísérletben szintén vizsgált, hasonló cefalosporin ismert mennyisége által kapott gátlási zónákkal való öszszehasonlitás alapján becsüljük. Ha a szubsztrát vegyület cefalosporin-nukleusz, ahol R hidrogénatom, úgy a termékként képződött savat analízis előtt acileznünk kell. Ezt a cefalosporin-technológiában jártas szakemberek megértik. Ilyen analitikai módszereket használunk az enzim oldatok vizsgálatára, amelyeket elkülönítés, tisztítás és töményítés során nyerünk. Az enzimet a találmány szerinti eljárás értelmében úgy használjuk, hogy a szubsztrát vegyületet érintkezésbe hozzuk vele. Előnyös és gazdaságos, ha az enzimes reakciót vizes reakcióelegyben végezzük. Mivel az enzimet nem izoláljuk tiszta alakban, nem tudjuk megadni bizonyos mennyiségű szubsztrát vegyület észter-hasításához szükséges enzim mennyiségét. Az alábbiakban ismertetett példákban bemutatjuk azt a módszert, amellyel az enzimet tartalmazó oldatok aktivitása mérhető. A vizsgáló mérheti az enzim aktivitását a megadott standard mérési körülmények között, és kiszámíthatja az adott mennyiségű szubsztrát adott idő alatt való észter-hasításához szükséges enzim-oldat mennyiségét. Az enzim újra-felhasználhatóságának és stabilitásának növelése érdekében előnyös, ha az enzimet megfelelő módszerekkel szilárd fázishoz kötjük. Az enzimek szilárd fázishoz való kötése ismeretes a szakemberek körében, általánosan használt módszerek alkalmazhatok az A49492 jelű törzzsel előállitott enzim kapcsán is. Előnyösen úgy kötjük az enzimet szilárd fázishoz, hogy dietil-amino-etilcellulózhoz kötjük ionosán. Ezt a polimert a DEAE Sephacel állítja elő [Pharmacia Fine Chemicals Corp., Piscataway, New Jersey). A DEAE-cellulózhoz való ionos kötéssel végzett immobilizáció további előnyös módszereit Tsao és Chen írja le a 4 063 017. sorszámú amerikai szabadalmi leírásban. A szilárd fázishoz kötött enzimet hatékonyan érintkezésbe hozzuk a szubsztráttal, vagy kromatografáló oszlopban, vagy tartályban, ahol keverjük a szuszpenziót. Ha oszlopot használunk, úgy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
