188709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cedfalosporin-metilészterek enzimes dezészterezésére
1 188 709 2 A találmány tárgya eljárás fermentációs úton nyert enzimmel cefalosporin-metil-észterek észterhasítására. Több enzimet találtak alkalmasnak szerves vegyületek szintézisére vagy hasítására. így például a 3 749 641 számú amerikai [Takeda Chemical Industries] szabadalmi leírásban arról olvashatunk, hogy nagyszámú mikroorganizmusból nyert enzimekkel lehetséges cefalosporin-származékok észterhasítása és acilhasítása. Az eszterázok irodalmát Myers és Hofstee foglalja össze [The Enzymes, Boyer, Lardy és Myrback szerkesztésében, 4. kötet, 28 — 29. fejezet. Academic Press (I960)]. A találmány további tárgya új enzim előállítása Streptomyces capillispira A49492 mikroorganizmussal. Az enzim megfelelő tenyésztési körülmények között keletkezik. A találmány szerinti enzimmel az (I) általános képlelü cefalosporin-metilésztereket észterhasíthatjuk, ahol az általános képletben : R hidrogénatom, fenil-glicil- vagy p-hidroxifenil-glicil-csoport; és R1 metilcsoport vagy klóratom. Az észterhasítást követően a megfelelő karbonsavak keletkeznek. A találmány tárgya eljárás a fenti általános képletü cefalosporin-metilészterek észterhasítására. A találmány szerint úgy járunk el, hogy a metilésztert a Streptomyces capillispira tenyésztésekor kapott enzimmel hozzuk érintkezésbe. A leírás során az összes hőmérsékletet Celsius fokban adjuk meg. A találmány szerinti eljárás során használt enzimet termelő mikroorganizmus új faj, neve: Streptomyces capillispira, sorszáma: A49492. A mikroorganizmust biológiailag tiszta tenyészet alakjában egy olyan földmintából izoláltuk, amit Svédországban gyűjtöttünk. A mikroorganizmust a Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois törzsgyüjteményébe letétbe helyeztük, ahol az NRLL 12279 sorszámot kapta. Az A49492 számú törzset az International Streptomyces Project (ISP) javaslatai alapján jellemeztük [Shírling és Gottlieb, Int. J. Syst. Bacteriol., 16, 313 — 40., (1966)]. Bizonyos kiegészítő vizsgálatokat is végeztünk. A sejtfal analízisét olyan tenyészettel végeztük, amely 24 órán át 30, °C hőmérsékleten növekedett élesztő —malátakivonat-levesen (ISP no. 2) [Int. J. Syst. Bacteriol. 16 (3), 313 - 340 ( 1966)]. A micéliumokat centrifugálással összegyűjtöttük és háromszor desztillált vízzel mostuk. A mosott sejteket fagyasztva szárítottuk, a sejtfalban lévő cukrokat Lechavaliert módszere szerint határoztuk meg [Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomyces into Genera, Workshop sponsored by the subcommittee on Actinomyces of the American Society for Microbiology, T. G. Pridham, Convener, held at the Institute opf Microbiology, Rutgers Univ., The Slate Unive. of New Jersey, New Brunswick, New Jersey (1971)]. A diamino-pimelinsav izomereket Becker és munkatársai szerint határoztuk meg [Appi. Microbiol., 12, 421 —423. (1964)]. Az eredményeket az alábbiakban adjuk meg. A növekedés pH-optimumának meghatározására 0,05 mólos puffereket használtunk ISP no. 2. 5 agarlemezeken: citromsav, pH 3,4, 5; 2-morfolinoetán-szulfonsav, pH 6; 3-morfolino-propán-szulfonsav, pH 7; N-trisz-(hidroxi-metil)-metil-glicin, pH 8; 2-cikIohexil-amino-etánszulfonsav, pH 8,5, 9,0, 9,5; 3-ciklohexil-amino-propán-szuífonsav, 10 pH 10, 10,5. Az agarlemezek pH-értékeit lapos felületi elektróddal határoztuk meg oltás előtt. A szénforrás-hasznosítást ISP no. 9. alap-táptalajon vizsgáltuk, a táptalajokhoz szűrővel sterilizált szénforrást adtunk, minden esetben 1,0 %-os vég- 15 koncentrációban. A lemezeket 30 °C-on inkubáltuk és 14 nap után olvastuk le az eredményeket. A melanoid-tipusú színanyag termelését ISP no. 1. levesen (tripton-élesztőkivonat), ISP. no. 6. agaron (pepton-élesztőkivonat és vas), ISP no. 7. aga^ ron (tirozin) és módosított (tirozin nélküli) ISP no. 7. agaron vizsgáltuk. A keményítő hidrolízisét ISP 4 agarlemezeken (szervetlen só - keményítő, ahogy azt Blazevic és 2& Ederer leírja a Principles of Biochemical Tests In Diagnostic Microbiology, John Wiley és Sons, New York, 1975 irodalmi helyen) határoztuk meg, jóddal. A lizozimmal szembeni rezisztenciát és a kazein, 3Q eszkulin, hipoxantin, tirozin és xantin bontását Berd módszere szerint vizsgáltuk [Appl. Microbiol., 25, 665-81 (1973)]. A nátrium-klorid és a szacharóz-toleranciát ISP 2. agaron határoztuk meg. Az antibiotikumokkal 35 szembeni érzékenységet olyan ISP 2. agarlemezeken mértük, amelyekre antibiotikum-tartalmú korongokat helyeztünk és amelyet 2 % vegetatív inokulummal oltottunk be. A kataláz-, foszfatáz- és ureáz-analízist Blazevic 40 és Ederer módszere szerint (lásd fentebb) végeztük. A színek neveit az ISCC-NBS Centroid Color Charts, standard mintaszám 2106 [National Bureau of Standards (1958)] szerint határoztuk meg. Az A49402 jól fejlett, felcsavarodott légmicéliu- 45 mókát fejleszt, így a Spirales-szekcióba sorolható Pridham és munkatársai szerint [Appl. Microbiol., 6, 52- 79 (1978)]. Ezt a morfológiát az összes olyan táptalajon megfigyeltük, amely lehetővé teszi a Iégmicéliumok fejlődését. Zabliszt-agaron (ISP 3.), 50 ISP 7. agaron, paradicsom-paszta-zabliszt-agaron és csapvíz-agaron a spirális morfológia kitűnően megfigyelhető. A spirálisok egyszerűek, nyitottak, laza, kél vagy három fordulatból álló gördület látható. A spóratartók 10-50 spórából álló láncot 55 hordoznak. A spórák alakja oválistól gömbszerüig változik, az elektromikroszkópos vizsgálatok szerint, a spórák mérete: 0,96 x 0,54— 1,19 x 0,71 pm. Az átlagos nagyság: 1,05 x 0,62 pm. A spórák felületének szerkezete szőrös. ISP no. 2. agaron koré- 60 mia figyelhető meg. A légmicéliumok a szürke színű sorozatba tartoznak Tresmer és Backus szerint [Appl. Microbiol., 11, 335-38. (1963)]. A szín általánosan barnásszürke. Az A49492 törzs nem-fragmentáló 6j szubszlrátumot vagy primer micéliumot fejleszt; 2
