188655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pektiniliáztartalmő enzimkomlex előállítására
1 188 655 2 A találmány tárgya eljárás pcktinliáz-tartalmú enzimkomplex előállítására, melynek során Aspergillus niger törzseket süllyesztett aerob körülmények között pektininduktor jelenlétében tenyésztünk. A pektinliáz általában gombaeredetű pektinbontó enzimkomplexumban található meg, többnyire kis koncentrációban. Jellemző tulajdonsága, hogy képes a nagymértékben észterezett pektinek vízfelvétel nélküli bontására molekulán belüli átrendezéssel, és hatásának kifejtéséhez nincs szükség pektinészteráz jelenlétére. Előnye, hogy konzervipari, borászati alkalmazásnál az énzim hatása során nem képződik az emberi szervezetre káros metilalkohol. Alkalmazásával lehetővé válik a hüvelyes főzelékfélék (bab, borsó, lencse stb.) főzési idejének csökkentése. A száraz hüvelyesek fogyasztása kellemetlen puffasztó hatással jár, ami irodalmi adatok szerint néhány bennük levő poliszacharid (stachióz, raffinóz) hatásának tulajdonítható, A fenti zöldségfélék pektinliázos kezelésével az említett kellemetlen hatású poliszacharidok elbonthatok, és ezáltal diétás termékek állíthatók elő. Ishií és Yokotsuka 1973. Aspergillus japonicus eredetű tisztított pektinliázzal és endopoligalakturonázzal külön-külön deríteni tudták a szőlőlevet. A pektinliáz és endopoligalakturonáz együttes adagolásával a derítő hatás fokozódott. Ugyancsak fenti szerzők állítottak elő pektinliázt Aspergillus soyae mikroorganizmussal. Az eddigi enzimelőállítási módszerek során a pektinliáz az enzimkomplexben csak kis mennyiségben keletkezett, ennek megfelelően jelentős tisztításra volt szükség, hogy a pektinliázt a többi enzimtől mentesen, vagy dúsítva állítsák elő. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy az eddigi előállítási eljárásokkal szemben olyan enzimkomplexet állítunk elő, amelyben a pektinliáz jelentős mennyiségben van jelen, pektinészteráz mellett. A tenyésztési körülményektől függően a pektinliáz-pektinészteráz arány eltolható bármely irányba. Vizsgálataink során olyan Aspergillus niger törzsekhez jutottunk, melyek a fenti eljárásban igen előnyösen alkalmazhatók. Az Aspergillus niger EMS 54 és NTG 42 törzseket az Országos Közegészségügyi Intézet Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél letétbe helyeztük, ahol azok a 00201 és 00202 letétbe helyezési számot kapták.- A találmány szerint úgy járunk el, hogy a fenti Aspergillus niger OKI 00201, illetve 00202 törzseket nitrogénforrást és ásványi sókat, valamint pektin-induktort és adott esetben további szénforrást tartalmazó táptalajon, süllyesztett, aerob körülmények között tenyésztjük, majd adott esetben a keletkezett enzimkomplexet a tenyészlétől elválasztjuk, és adott esetben a pektinliázt elválasztjuk a pektinészteráz-komponenstől. A fenti előállítási eljárás szakaszos és folytonos fermentációval egyaránt történhet. A találmány szerinti eljárás során a fermentációs tápközeg szénforrásként előnyösen természetes pektinoldatot (cukorrépaszelet kivonata) vagy cukorrépaszeletet tartalmaz. Alkalmazható azonban természetes bármely más, pektintartalmú induktor is, így búzakorpa, korpakivonat, és különféle pektin tartalmú zöldség-gyümölcs szövet, illetve hulladék stb. A répakivonat előnyösen 2—6% szárazanyag-tartalmú oldat formájában, száraz répaszelet előnyösen 0,5—4% mennyiségben alkalmas szénforrásként, illetve induk-2 tarként. Nitrogénforrásként előnyösen alkalmazható az ammóniumszulfát, célszerűen 3-8 g/liter mennyiségben. Ugyancsak alkalmazható nitrogénforrásként kukoricalekvár, előnyösen 0,5—10 g/liter mennyiségben, vagy tejsavó por 0,5—10 g/liter mennyiségben. Természetesen bármely más — a fermentációs technikában általánosan alkalmazott — nitrogénforrás hasonló módon alkalmazható. Ásványi sókként célszerű a magnézium-szulfát és kálium-dihidrogén-foszfát adagolása, valamint elemnyomok közül a mangánszuílát, kobaltnitrát, cinkszulfát, vasszulfát használata. A magnéziumszulfát és káliumdihidrogén-foszfát előnyösen 0,5—5, illetve 0,5—1 g/liter mennyiségben, az elemnyomok előnyösen 0,0005- 0,005 g/liter koncentrációban alkalmazhatók. Használható ezenkívül a tenyésztés során bármely más nitrogénforrás, ásványi só, illetve a mikroorganizmus anyagcseréjét kedvezően befolyásoló bármely más faktor is. . A találmány szerinti eljárás inokulumaként célszerű előnyösen 24 órás vegetatív tenyészetet alkalmazni. Inokulum táptalaj összetétele például a következő lehet: 950 ml répaszclet kivonatba (szárazanyag-tartalom: 2%) adagolt 5 g ammóniuin-szulfát, 0,5 g magnézium-szulfát, 1,0 g kálium-dihidrogén-foszfát, 50 ml malátacsíra kivonat és elemnyomok (Co++, Zn++, Fe++) 0,5—0,5 mg mennyiségben, pH = 5,5. A tenyésztés során a levegőztetés mértéke befolyásolhatja a pektinliáz és pektinészteráz képződését. Kis oxigénátadási sebesség (OTR) pektinészteráz-képződésének, a közepes OTR pedig a pektinliáz képződésének kedvez. A levegőztetés szakaszos tenyésztési körülmények között, előnyösen 26—179 mmól/liter/óra, oxigénátadási sebességtartományt biztosít. A pektinliáz körülbelül 60 mmól/liter/óra OTR-nél, illetve 40—90 mmól/liter/óra OTR tartományban képződik kedvezőben. A pektinészteráz képződésének előnyösen a 10—15 mmól/liter/óra OTR biztosítása bizonyult a legjobbnak. Amenynyiben a fermentációt folyamatosan végezzük, célszerű azt például a következő összetételű tápközeggel indítani: 10 liter tápközeg 4% szárazanyag-tartalmú répakivonatot, 50 g ammóniumszulfátot, 10 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 5 g magnézium-szulfátot és 500 ml korpakivonatot tartalmaz, a tápközeg pH-ja = 5. A szakaszos tenyészet folytonosra állítása 30—54 órás szakaszban lehetséges, a hígítási sebesség fokozatos növelésével. A liígítási sebesség optimális tartománya 0,036—0,06/óra. Hígító tápközegként előnyösen alkalmazható 2—3% szárazanyag-tartalmú répaszeJet kivonat, amelybe literenként 5 g ammónium-szulfátot, 5 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,5 magnézium-szulfátot, 50 ml 2% szárazanyag-tartalmú korpa-kivonatot, valamint elemnyomokat (CoMnZnFe) 0,0001—0,001 g mennyiségben adagolunk. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa 950 ml répaszelet-kivonatba (szárazanyag-tartalom: 2%) 5 g ammónium-szulfátot, 0,5 g magnézium-szulfátot, 1,0 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 50 ml malátacsíra kivonatot, valamint 1—1 mg Co++, Mn”, Zn++ és Fe++ sót adunk és az oldat pH-értékét 5,5-re állítjuk. Az oldatot Erlenmeyer-lombikba helyezzük, sterilezzük, majd lehűlés után Aspergillus niger OKI 00201 ferde tenyészetről beoltjuk. A lombikot körkörös rázógépen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
