188618. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív enkefalin-analógok előállítására
1 188 618 2 méretű, CJ8 fordított fázisú szilikagéllel töltött, a fenti puffer-oldattal egyensúlyba hozott oszlopra. Az elutumot 280 nm hullámhossznál spektrofotometriásán vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Az így kapott szilárd anyagot feloldjuk 8 ml 50 %-os ecetsavban és az oldatot felvisszük egy 2,5 X X 90 cm méretű G-10 Sephadex oszlopra. Az oszlopot 50 %-os ecetsavval eluáljuk, és az elutumot 280 nm hullámhossznál spektrofotometriásán vizsgáljuk. A megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Ily módon fehér színű, szilárd anyag formájában 743 mg (hozam:42 %) cím szerinti vegyületet kapunk. [a]p = 4- 35,58° (c = 0,5,1 mólos ecetsav). Analízis a C32HÍ9N5O8 képlet alapján (mólsúly: 631,8): számított: C 60,84; H7,82; N 11,09; talált: C 61,15; H 7,22; NI 1,32. Aminosav-analízis: Gly, 0,74; Ala, 1,09. 2. példa L-(N-Metil)-tiroziI-D-alanil-glicin-«N-etil-N-[l-(4'-fluor-benzil)-2-dimetil-amino]-etil»amid-diacetát A cím szerinti vegyületet az 1. példában leírt módon állítjuk elő, e vegyület jellemző tulajdonságai: [c^d ~ + 61,75° (c = 0,5,1 mólos ecetsav). Analízis aC32H48N508 képlet alapján (mólsúly:649,8): számított: C 59,15; H 7,45; N 10,78; talált: C 58,86; H 7,17; N 10,62. Aminosav-analízis: Gly, 0,68; Alá, 1,00; NH3, nyomok. Térdeszorpciós tömegspektrum: molekulaion: 530. 3. példa L-(N-Metil)-tirozil-D-(0-metil)-szeríl-glicin[N-etil-N-(l-benzil-2-dimetil-amino)-etil]amid-diacetát a) lépés Nalfa-tercier-Butoxi-karbonil-glicin-[N-etil-N-(l-benzil-2-dimctil-amino)-etil]-amid 40 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 5,3 g (26 millimól), az 1. példa b) lépésében leírt módon kapott terméket. Ezután az elegyhez hozzáadunk 4,5 g (26 millimól) Nalfa-tercier-butoxi-karbonil-gIicint, 4,5 ml (26 mitlimól) diizopropil-etil-amint, és 11,59 g (26 millitnól) benzotriazolil - N - oxi - trisz - (dimetil - amino) - foszfónium-hexafluorofoszfátot (Sempa-Chimie). A reakcióelegyet 48 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot feloldjuk etil-acetát és 1 normál vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat kétfázisú elegyében. Az elegy pH-ját 5 normál nátrium-hidroxid-oldattal 10,0-ra állítjuk, az etil-acetátos részt elválasztjuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszáritjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékként kapott olajat feloldjuk etil-acetátban, az oldatot felvisszük egy Water’s-féle szilikagél oszlopra, és az oszlopot egy System 500A jelzésű Water’s-féle preparatív folyadék-kromatográfban szakaszos gradiens elucióval (oldószer: etil-acetát-»-tetrahidro-furán) eluáljuk. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és a terméket elkülönítjük. Ily módon 7,3 g (hozam: 77 %) cím szerinti vegyületet kapunk. NMR-spektrum: delta (fenil), 7,3; delta (Boc), 1,5; delta [-N(CH3)2 ], 2,5. b) lépés Na fa-tercier-Butoxi-karbonil-D-(0-metil)-szeril-glicin[N-etil-N-(l-benzil-2-dimetil-amino)-etil]-amid 25 ml trifluor-ecetsav és 5 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 7,3 g (20 millimól), a fenti a) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet félórán át 0°C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson, melegítés nélkül ledesztilláljuk. A maradékként kapott olajat dietil-éterrel többször eldörzsöljük, az oldószert minden esetben leöntjük. A maradék olajat ezután feloldjuk etil-acetát és víz kétfázisú elegyében, az elegy pH-jál 2 normál nátrium-hidroxid-oldattal 10,0- ra állítjuk, a szerves részt elválasztjuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon 4,7 g (hozam: 89%) olajos termeket kapunk. 1,7 g (5,35 millimól), Jaeger, M., Ishric, S. és Wickerhauser, M. módszerével [Croat, Chem. Acta, 28, 5 (1956)] előállított Nalfa-tercier-butoxi-karbonil-D-(0- meti!)-szerin-ciklohexil-amin-sót 2 normál sósav és etilacetát lehűtött elegyével semlegesítünk. Az etil-acetátos részt elválasztjuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az így kapott Na!!a-tercier-butoxi-karbonil-D(O-metil)-szerint feloldjuk 20 ml dimetil-formamidban, az oldatot -15 °C hőmérsékletre hűtjük, és az oldathoz keverés közben, gyorsan hozzáadunk 0,55 ml (5 millimól’ N-metil-morfolint és 0,66 ml (5 millimól) klórhangyasav-izobutil-észtert. A reakcióelegyet —15 C hőmérsékleten keverjük, és ezalatt az előző bekezdésben leírt módon kapott peptid szabad bázis formáját feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, az oldatot 0 C hőmérsékletre hűtjük, majd hozzáadjuk a fent leírt módon előállított vegyes anhidridhez. A reakcióelegyet 3 órán át —15 °C hőmérsékleten, majd 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az oldószert csökkentett nyomáson ^desztilláljuk, a maradékként kapott olajat feloldjuk etil-acetát és víz kétfázisú elegyében, és az elegy pH-ját 2 r orrnál nátrium-hidroxid-oldattal 10,0-ra állítjuk. A szerves részt elválasztjuk, vízmentes magnéziumszulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A 2,2 g súlyú maradékot feloldjuk etil-acetátban, és az oldatot felvisszük egy Water’s-féle szilikagél oszlopra. Az oszlopot egy System 500A jelzésű Water’s-féle preparatív folyadék-kromatográfban szakaszos gradiens elucióval (oldószer: etil-acetát -* etil-acetát és tetrahidro-furán 1:1 arányú elegye) eluáljuk. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiás módszerre! vizsgál5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
