188507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inaktivált galamb herpesvírus vakcina előállítására
1 188 507 2 a fertőző folyadék vírustartalmától függően 3—7 nap alatt érhető el a maximális sejtkárosító hatás. A vírustartalmú folyadéknak legalább 105 TCID50/0,1 ml infektív titerűnek kell lennie. Ekkor összegyűjtöttük a vírusfolyadékot, és inaktiváltuk a vírust. A megfelelő vakcina minőség elérésére olyan inaktiválási eljárást kívántunk kiválasztani, amely a vírus fertőzőképességét tökéletesen megszünteti anélkül, hogy a protektivitásban jelentős szerepet játszó felületi antigéneket károsítaná. Ennek érdekében többféle inaktiválás! eljárást próbáltunk ki és a következő eredményeket kaptuk: formalin 500 fig/ml betopropiolakton 1000 jug/ml etilénimin 500 jug/ml etil-etilénimin 500 /Ug/ml Az inaktiválás eredményességét-az inaktivált vírusszuszpenziónak csirkeembrió-fibroblasztra való oltásával ellenőriztük Vizsgáltuk az esetleg létrejövő cytophatogen hatást, valamint a felülúszó tápfolyadék vírus tartalmát titrálással. Megállapítottuk, hogy esetünkben megfelelőnek, a formalin és az etilénimin használata bizonyult. Véglegesen az etilénimin használata mellett döntöttünk, mivel ez az anyag gyors és biztos inaktiválást tesz lehetővé anélkül, hogy a protein típusú antigének hatását befolyásolná. Az inaktivált anyag antigénhatását, a tartós antigéningert különböző olajos adjuvánsok alkalmazásával kívántuk elérni. A különféle olajokkal kísérleti vakcinákat készítettünk és ezekkel galambokat oltottunk. Az értékmérés vírusneutralizációs próbával történt. Eredmények adjuválószer 0. 14. VN titer 21. nap 28. 35. oltási reakció Bayol F 2 4 8 32 32 + Marcol 52 2 4 8 32 32 — Shell o. 68 2 4 8 16 16-Shell o. 32 2 4 4 4 4 — Shell o. 15 2 4 4 4 4 — Shell R. 68 2 4 4 6 6 — Shell R. 32 2 2 2 4 4 — Shell R. 15 2 2 2 4 4 — Techn. vazelin 2 4 8 ' 32 32 — Kozm. vazelin 2 4 8 32 32 — Az inaktivált vírustartalmú folyadékhoz 1:1 arányban adjuvánst adtunk és azzal alaposan összekevertük. Az így kapott vakcinát (mint később részletezzük) a legelőnyösebben oly módon használjuk, hogy az oltást célszerűen megismételjük. A vakcinát elsősorban tenyészgalamb előállító nagyüzemekben, sportgalambállományokban, kistenyésztői tenyészállományokban alkalmazhatjuk. A fenti állományokban a tojópárokat, illetve a tenyészcélból kiválasztott 30 napot betöltött növendékeket vakcinázzuk. A találmányt az alábbi példával világítjuk meg közelebbről, az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa Inaktivált galambherpesz vakcina előállítása A vírusantigént primer csirkeembrió-fibroblaszt sejttenyészetben állítjuk elő, A teljesen összenőtt tenyészeteket a növesztő tápfolyadék leöntése után olyan MEM—EARLE oldattal készült vírusszuszpenzióval fertőzzük, amely 0,1 ml-ként kb. 105 TCID50 szövetoltó vírust tartalmaz. A palackokat 1 órányi 37 °C hőmérsékleten történő adszobeáltatás után MEM—EARLE fenntartó oldattal feltöltjük. 37 °C-on 3—5 nap alatt teljessé válik a vírus sejtkárosító hatása. Ekkor történik az aratás. Az összegyűjtött vírusfolyadék sterilitását a VI. Gyógyszerkönyv előírásai szerint vizsgáljuk. Steril és legalább 105 TCID5O/0,l ml titerű vírusanyagot használunk a vakcina készítéséhez. A vírusszuszpenzió inaktiválását a sterilitási vizsgálat és a vírustiter meghatározása után a legrövidebb idő elteltével, de legalább 30 napon belül 2—4 °C-os hűtőben tartás után el kell végezni. Az inaktiválást 24 órán át szobahőmérsékleten, 500 jug/ml végkoncentrációjú etiléniminnel végezzük. Az etilénimint az inaktiválás előtt állítjuk elő brómetilaminból, lúgos pH-n, híg vizes oldat formájában. Az inaktiválás befejeztével az etilénimint nátriumt Oszulfáttal semlegesítjük majd a pH-t glicin-sósav puffcrrel pH 7,2 értékre visszaállítjuk. Az inaktiválás során a vírusszuszpenzió antibakteriális védelme 300 pg/m! gentamicinnel történik. Inaktiválás után újabb sterilitási vizsgálatot végzünk. A vakcina-alapanyag adjuválására csak a kedvező eredményű sterilitási és ártalmatlaiisági vizsgálat után kerülhet sor. Adjuvánsként kozmetikai vazelint használunk, melyet autoklávban sterilizálunk. Steril körülmények között, Rannie típusú homogenizátor segítségével 50-80 atm. (~5—8 • 106 Pa) nyomáson az inaktivált vírusszuszpenziót egyenlő arányban keverjük össze az olajos immunadjuvánssal. A vírusantigént inaktiválás előtt és után, majd a vakcinát adjuválás után +2 — +4 °C hőmérsékleten tartjuk. A fentiek szerint előállított oltóanyaggal kísérleteket végeztünk az ártalmatlanság és a hatékonyság megállapítása végett. Az ártalmatlanságot úgy vizsgáljuk, hogy 4 hónapos 50—70 dkb súlyú galambokat 0,60, 5 ml vakcinával oltunk nyakbőr alá. A 14 napos megfigyelési idő alatt galambherpesz vírusra utaló megbetegedés vagy elhullás rém fordulhat elő. Hatékonysági vizsgálatok A vakcina hatékonyságának laboratóriumi körülmények közötti kipróbálására 20 db SPF kakast és 10 db 5 hetes galambot 0,5 ml vakcinával oltottunk nyakbőr alá. Az állatokat 0. 7. 10. 14. 21. 28. 35. napon vizsgál-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
