188211. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens glikozilált hemoglobin meghatározására
1 I882I1 2 Minta száma Hemoglobin Inoz.il-hexafoszfát (mól/liter) n-Bulil-izocianíd (mól/liter) lixtinkció (mii) i llbA, 5 ■ I0'5 0 0 2 llbA, 5 ■ 1(T5 5 - 10 4 1X8 3 llbA, l) 5 ■ IO'-* 194 4 11 bA„ 5 • i(r5 0 0 5 HbA„ 5 • 10 5 5 • 10 4 0 6 HbA0 0 5 ■ 10 1X4 Az oldatot 160 mg előbb leírt módon előállított haptoglobin-Sepharose preparátummal 1 percen át rázás közben intenzíven elegyítjük. Utána ditionittartalmú púderral, majd kétszer csak púderral mossuk, és a felülúszótól elválasztjuk. A haptoglobin-Sepharose-ra kötött hemoglobint pszeudo-peroxidáz aktivitása alapján gvajakollal ismert módon határozzuk meg. Ezen célból a centrifugált haptoglobin-Sepharose-hoz 1 ml 30 mmól/ liter koncentrációjú gvajakol-oldatot adunk 0.1 mól/liter töménységű 4,0 pH-jú acetátpufferban. A reakciót ezután 50 gl 1 %-os hidrogén-peroxid oldattal beindítjuk. Az elegyel 5 perc reakcióidő után lecentrifugáljuk a Sepharose-ról, és a keletkezett színezék extinkcióját a felülúszóban 436 rímnél lemérjük. A talált extinkcióértékeket az. előbb megadott összeállításban tüntettük fel. A talált extinkcióértékek azt mutatják, hogy egyedül inozil-hexafoszfát jelenlétében sem a glikozilált, sem a nem glikozilált hemoglobint nem köti meg a haptoglobin-Sepharose. n-Bulil-izocianid jelenlétében inozit-hexafoszfát hozzáadása nélkül a haptoglobin és mind a nem glikozilált, mind a glikozilált hemoglobin között kölcsönhatás jön létre. A nem glikozilált és glikozilált hemoglobin közötti különbséglétei nagyon jó pontossággal akkor lehetséges, ha a mintához inozil-hexafoszfátot és n-bulil-izocianidot adunk. Az előbb felsorolt extinkcíóértékek azt mutatják, hogy ebben az esetben a hemoglobinnak csak a glikozilált része kötődik a haptoglobin-Sepharose-hoz. 4. példa: 1 ml 0,05 mól/liter koncentrációjú 6,70 pH-jú bisz-trisz-puO'erral készült 8 x 10~7 mól/liter töménységű hemoglobin oldatot a dezoxi-formába való átalakítás céljából körülbelül 5 mg nátriumditionittal reagáltatunk. Hozzáadunk 25 pl 0,1 mól/liter koncentrációjú nátrium-nitrit oldatot. Körülbelül 5 perc reakcióidő után inozit-hexafoszfátol adunk hozzá a következő koncentrációkban: Minta száma Hemoglobin Inozit-hexafoszfát (mól/liter) Extinkció (niE) 1 HbA, 0 224 2 HbA, 5 • HT5 190 3 HbA0 0 219 4 HbA0 5 • 10 5 16 Az oldatot 160 mg haptoglobin-Sepharosekészítménnyel - amelyet a 3. példában megadottakhoz hasonlóan állítottunk elő - rázás közben egy percig intenzíven elegyítjük, és a 3. példában leírtakhoz hasonló módon kezeljük tovább. A haptoglobin-Sepharose-hoz kötött hemoglobin-részt a 3. példában megadottakhoz hasonlóan határozzuk meg. A talált extinkciós értékeket az. előbbi összeállításban tüntettük fel. A talált extinkcióértékek azt mutatják, hogy inozit-hexafoszfát jelenlétében a glikozilált hemoglobin sokkal erősebb mértékben kötődik a haptoglobin-Sepharose-hoz, mint a nem glikozilált hemoglobin-forma. 5. példa: A 3. példában megadott módon olyan hemoglobin tartalmú mintákat állítunk elő, amelyekben a glikozilált hemoglobin rész 0-100%-ig terjed. A mintákat mindenkor 5 mg nátrium-ditionitial, 5 x 10 5 mól/liter inozit-hexafoszfáttal és 5 x 10~4 mól/liter n-butil-izocianiddel elegyítjük, és a 3. példában megadottak szerint kezeljük tovább. Haptoglobinreagensként egy haptoglobin-Sepharosepreparátumot használunk, amelyet a 3. példában megadottakhoz hasonló módon állítunk elő, azonban kötési kapacitása 1,7 x 10'8 mól hemoglobin/ g preparátum. A 3. ábrán a talált extinkcióértékeket az összhemoglobin glikozilált hemoglobin százalékos részének függvényében adjuk meg. A 3 ábrán megadott standardgörbe segítségével határozható meg egy mintában lévő ismeretlen glikozilált hemoglobin-tartalom az itt megadott eljárással 6. példa: Az 1, és 2. példában leírtakkal analóg módon eljárva oxihemoglobint (hemolizátum mosott éritrocitákból) 0,05% koncentrációjú oldattá oldunk 50 mmól/liter, 6,7 pH-értékü bisz-trisz-pufferben. Ennek az oldatnak egy részét inozit-hexafoszfáttal elegyítjük, 0,2 mmól/liter koncentráció eléréséig. A hemoglobin-oldat 100-100 pliterét 2,2 ml olyan haptoglobin-oldattal (45,5 mg haptoglobin, 50 mmól/liter, 6,7 pH értékű bisz-trisz-pufferben) keverjük össze, amely járulékosan az alábbi - ionos kötésekre stabilizáló hatású - anyagokat tartalmazza, a Táblázatban megadott mennyiségben: Adalékanyag Koncentráció A felig maximális [g/liter] fluoreszcencia-kioltásig terjedő idő inozit-hexa- inozit-hexafoszfát fos/fal lávollétébcn jelenlétében nélkül-1.40 s 5.5 s szacharóz 10 0.X0 s 7.0 s glicerin 10 1.25 s 6.X s glicerin 100 0,75 s ■ 11.X s PECT 40 000 10 0.90 s HU s PEG* 40 000 100 2.25 s 35.0 s +polietilénglikol A hemoglobin haptoglobinon való kötési reakciója sebességének mértékéül azt az időtartamot mértük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
