188211. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens glikozilált hemoglobin meghatározására
1 188 211 2 A találmány glikozilált hemoglobin vérmintákban való meghatározására szolgáló eljárásra vonatkozik. Glikozilált hemoglobin (HbAj) a hemoglobin (HbA0) nem enzimatikus glikozilálásával keletkezik. Normálisan a glikozilált hemoglobin koncentrációja a vérben mintegy 5% az összhemoglobinra vonatkoztatva. Cukorbetegeknél ez a koncentráció a 2-4-szeresére emelkedik. Az összhemoglobin glikozilált részének meghatározása az utóbbi években kapott jelentőséget a cukorbetegség-diagnosztikánál [lásd L. Jovanovic és C. M. Peterson, Am. J. Med. 70, 331-338 (1981)]. Az egyes hemoglobin molekulák és a glükóz közti reakció stabil reakcióterméket eredményez, amely az erithrociták egész élettartama alatt, tehát körülbelül 100-200 napig megmarad. A vércukortartalom rövididejű csökkenései a glikozilált hemoglobin koncentrációját döntően nem befolyásolják. A glikozilált hemoglobin koncentrációja ezért viszonylag pontosan tükrözi az átlagos glükózkoncentrációt egy paciens vérében hosszú időtartamon át. Több eljárás ismeretes az összhemoglobin glikozilált részének meghatározására. Klinikai laboratóriumokban a legszélesebben kromatográfiás elválasztási eljárások terjedtek el. Ezeknél a hemoglobin glikozilált részét a nem glikozilálttól egy kromatográfiás oszlop, egy mikrooszlop segítségével vagy pedig a HPLC-módszer (HPLC = high pressure liquid chromatography = nagynyomású folyadékkromatográfia) segítségével választjuk el, amikor az oszlopok valamilyen ioncserélővel, például BioRex 70-nel vannak töltve. Mindezek a módszerek azonban nagyon érzékenyek a pH- érték, a hőmérséklet, az ionkoncentráció változásaira. Az elválasztási eljárásokat ezért nagyon óvatosan kell elvégezni, hogy optimális eredményeket kapjunk (lásd az előbb hivatkozott irodalmat a 332. oldalon). A 2 950 457 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratból ismeretes egy eljárás a glikozilált hemoglobin vérmintákban való meghatározására, amelynek során egy vérminta spektroszkópiai tulajdonságainak egy allosztérikus effektor hozzáadásakor fellépő változásait hasznosítják a HbAt meghatározására. Ekkor csak a hemoglobin nem glikozilált főtömegét befolyásolják. A mért extinkciókülönbségek az illető tartományban nagyon kicsik. Azonkívül még kisebbek lesznek, ha az összhemoglobinban a glikozilált rész nő. A találmány feladata ezért az volt, hogy egy olyan eljárást dolgozzon ki, amellyel a glikozilált hemoglobint gyors és technikailag egyszerűen elvégezhető módon, megbízhatóan és pontosan meg lehet határozni. Ezt a feladatot a találmány szerinti eljárással oldottuk meg, amelynek során a vérmintának a hemoglobin eritrocitákból való felszabadítását szolgáló kémiai és fizikai kezelése után a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin-résznek haptoglobin segítségével való differenciálását hajtjuk végre, és vagy a hemoglobin és haptoglobin közötti reakciót követjük kinetikusán, vagy a hemoglobinnak a haptoglobinhoz kötött, illetve a haptoglobinhoz nem kötött részét mérjük ismert módszerekkel. A glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálása alatt valamennyi olyan módszert értjük, amelyek lehetővé teszik a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin megkülönböztetését kémiai és fizikai tulajdonságaik alapján. A jelen találmány tárgya tehát eljárás glikozilált hemoglobin meghatározására vérmintákban, amelynek során először a vérminta kémiai vagy fizikai kezelésével felszabadítjuk az eritrocitákból a glikozilált és nem glikozilált hemoglobint, adott esetben a hemoglobint methemoglobinná alakítjuk, ezután a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálását végezzük el, és végül a hemoglobin nem glikozilált vagy glikozilált részét is ismert módon meghatározzuk; a találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálását haptoglobin segítségével hajtjuk végre. A találmány szerinti eljárás valamilyen alkalmas pufferrendszer jelenlétében hajtható végre. Alkalmas pufferrendszerként a találmány keretén belül minden 4,0-8,5, előnyösen 6,0-7,0 pH-érték között hatásos puffer alkalmazható. Különösen alkalmas a foszfát- és a bisz-trisz-puffer. A haptoglobin (Hp) plazmaprotein. Hosszú ideje ismeretes, hogy az eritrocitákból szabaddá vált hemoglobint haptoglobin képes megkötni [lásd erre vonatkozólag T. Sasazuki, Immunochemistry 8, 695-704 (1971)]. Meglepő módon azt állapíthattuk meg, hogy a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin kötődési viselkedésük szempontjából haptoglobinnal szemben eltérően viselkednek. A glikozilált hemoglobin gyorsabban kötődik a haptoglobinhoz, mint a nem glikozilált hemoglobin. Ez következik például egy haptoglobin-tartalmú méröoldat fluoreszcenciaintenzitásának glikozilált és nem glikozilált hemoglobin hozzáadása utáni csökkenéséből. A fluoreszcenciasugárzás mérése, amely mérték a hemoglobin és haptoglobin közötti kölcsönhatásra, ismert módon történhet. Az 1. ábrán a fluoreszcenciaintenzitás csökkenése látható mindkét mérőoldatra az idő függvényében. Látható, hogy a fluoreszcenciaintenzitás glikozilált hemoglobin hozzáadása után gyorsabban csökken, mint nem glikozilált hemoglobin hozzáadása után. Ez arra utal, hogy a haptoglobin és a glikozilált hemoglobin közötti kötési hatása erősebb, mint a haptoglobin és a nem glikozilált rész közötti. Az összhemoglobin glikozilált részének meghatározására szolgáló eljárást célszerűen úgy hajtjuk végre, hogy először szokásos módszerek szerint szabaddá tesszük az eritrocitákból a glikozilált és a nem glikozilált hemoglobint. A hemolizált vérmintát, adott esetben a hemoglobin methemoglobinná való átalakítására alkalmas valamilyen oxidálószer előzetes hozzáadása után, egy haptoglobint tartalmazó oldathoz adjuk. A hemoglobin glikozilált része előnyösen a haptoglobinhoz kötődik. A hemoglobin illetve methemoglobin kötött részének a nem kötöttől való megkülönböztetésére szokásos mérési módszereket alkalmazzunk. Különböző hemoglobintartalmú minták mérésével, ameI 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
