188190. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a természetben előforduló ergolén-vázas alkaloidot az ergokrisztint tartalmazó drog parazita módon történő előállítására
1 188 190 2 A találmány tárgya eljárás a természetben előforduló ergolén-vázas alkaloidot, az ergokrisztint tartalmazó drog előállítására rozsra virulens új Claviceps purpurea törzs spóratenyészetével. Az ergotoxin három komponensének hidráit származékai, szabatosabban ezek keverékei: a dihidroergokornin, a dihidroergokriptin, valamint a dihidroergokrisztin a gyógyászatban ma is nélkülözhetetlen vegyületek, adrenolitikus hatásuk, szerotonin aktivitásuk stb. következtében [Straub., F. B. Biológiai Lexikon 1. kötet 171-172. o. (1978) Akadémiai Kiadó, Budapest]. ismeretes továbbá az is, hogy a természetben előforduló ergolén-vázas alkaloidok két egymástól eltérő módon állíthatók elő:- steril fermentációval ún. szaprofita módon, vagy- parazita eljárással rozs fertőzése útján. Ismeretes e két módszeren kívül totál szintézisük is, ez utóbbi azonban jelenleg még magas költsége miatt a gyakorlatban nem járható út. Parazita úton történő ergokrisztint termelő törzsek már ismertek (154 035 és 176 003 számú magyar szabadalmi leírások). E törzsek spóratenyészetével előállított drogok azonban csak 3-6 mg/g alkaloidot tartalmaztak. A szaprofita, ill. parazita úton történő anyarozs alkaloidok előállítása közötti verseny ez ideig még nem dőlt el egyik módszer javára sem, ezért mindkét út továbbfejlesztése kötelező szükségszerűség. A találmány célkitűzése: jobb hozammal, magasabb ergokrisztin tartalmú törzs előállítása, amely- mesterséges táptalajon agar-agar felületen és süllyesztett, levegőztetett tenyészetben jól spórázik,- a spórák megfelelően rezisztensek, tehát jól tartósíthatok,- a spórák életképesek és virulensek, tehát újra táptalajközegbe juttatva 98-100%-ban kicsíráznak, és rozsra juttatva azt fertőzik,- a területegységenként kifejlődő drog mennyisége magas,- a drog főalkaloidtartalma magas, és a főalkaloidokon kívül csak jelentéktelen mennyiségű mellékalkaloido(ka)t tartalmaz. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott új törzs előállításának fontos lépései: 1. A Claviceps purpurea törzs kinemesítése. 2. A törzs fermentációs elszaporításával rozsfertőzésre alkalmas spórák előállítása és ezek konzerválása a felhasználásig. Az új törzs előállítását az alábbi módon végeztük: Vad gramineákról (Agropyron repens, Dactylus glomerata, Lohlium sp.) gyűjtött és rozsra szoktatott Claviceps populációkból indítottuk meg a szelekciót. A kiindulási populáció termelőképessége: 5,0 mg/g ergokrisztin. A kiindulási populáció házi jelzése: KGy-2, amelyet az Országos Közegészségügyi Intézetnél (OKI) 00 224 szám alatt helyeztünk letétbe. A kiindulási populáció az ivaros folyamatok következtében széles genotípus spektrumot és kiegyenlített életképességet biztosított. A szelekció során a plusz variánsok kiemelése nagyszériás analitikai módszerrel történt. További szelekció történt a plusz variánsok között a mikrobiológiai kezelhetőség szempontjából. Az ily módon kiemelt anyag ivartalan fenntartása, ill. felszaporítása következett parazitafertőzés céljából. A parazita életciklus alapján kapták e törzsek az utolsó gyakorlati szempontú minősítést. Az új törzs, amelynek házi jelzése KGy-300 és amelyet az Országos Közegészségügyi Intézetnél (OKI) 00 216 szám alatt helyeztünk letétbe, előnyös tulajdonságokkal rendelkezik. Az új törzs a fermentációs és a természeti eljárásokban az alábbi eredményt adja: OKI 00 216 felületi spóratermelő képes-2-10° spóra/cső seg fermentlé spóraszám 5—6-108 spóra/ml oltóspóra készítmény csíra-95-98% képessége ezer szem súlya 170-190 g droghozam (kísérleti üzem-200-250 kg/ha ben) ergokrisztin tartalom 10-12 mg/g mellékalkaloidok: ergomet-0,1-0,3 mg/g rin ergotamin 0,1 mg/g egyéb szennyezés, pl. zsíros 15-25% olajtartalom Az új törzs (OKI 00 216) morfológiai jellemzői: a) Maláta-agaros táptalajon (6 s% holland malátakivonat, 2 s% Bacto-agar) 14-18 nap múlva 1,5-2,5 cm átmérőjű fehér, rövid légmicéliumos telepeket hoz létre. A telepek a táptalaj felszínén 1-2 mm-re emelkednek ki. 10-12 nap múlva konidió-spórákat hoznak létre, amelyek 2,5-4 p méretűek. b) Malátakivonatot, tripkazint és citromsavat tartalmazó táptalajon (lásd példa) dúsan növő, el nem ágazó, köteges gombafonalakat hoz létre, amelyek 2-4 g vastagok. 3-4 nap múlva megjelennek a konidiumtartók és a rajtuk lefűződő konidiospórák. c) Citrát, mannitos szubmers kultúrában köteges, kissé elágazó micélium-tömeg képződik, amelyen 38-44 óra múlva konidio-spórák fűződnek le. A spóraképzés az 5. napon befejeződik, 5—6-10® spóra/ml értékkel. A kialakult spóratömeg heterogén, átlag mérete: 4 p. Megjegyezni kívánjuk, hogy Claviceps gomba fajok esetében, ellentétben a többi gombákkal, tapasztalataink szerint a morfológiai jegyek alig jellemzőek, ezzel a ténnyel magyarázható az eddig ismert törzsekkel való közeli hasonlóság. A találmány szerinti eljárás közelebbről az alábbi példával szemléltethető: Példa Az OKI-nál 00 216 szám alatt deponált törzs 24 napos maláta-agar tenyészetével 5 literes üvegfermentorban az alábbi összetételű táptalajt oltottuk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
