188113. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az 5057-B jelzésű új antibiotikum bázikus sóinak előállítására
1 188 113 2 :Az alkalmazott szilikagél: Kieselgel GF254 Merck Co. Oldatrendszer Rr érték Kloroform - metanol (20:1) 0,30 Etil-acetát - metanol (20:1) 0.64 n-Hexán - etil-acetát (1:2) 0,62 Benzol - etil-acetát (1:1) 0.37 (11) A baktériumölő hatást az alábbi táblázat mutatja, amelyben a tápközegek: a - szívinfúziós agar, b - Kirchner-féle félfolyékony agar, c -búrgonya-szacharóz agar és d - Sabouraud-féle 3"„ glükózos agar: Minimális Vizsgált mikroorganizmus gátló koncentráció [pg/ml] közeg Staphylococcus aureus FDA 209 PJC-1 Staphylococcus aureus 0.5 a (ttíely rezisztens penicillinnel, streptomicinnel, kanamicinnel, klóramfenikollal és tetraciklinekkel szemben) 0,5 a Bacillus subtilis ATCC-6636 0.5 a Sarcina lutea NI HJ 2 a Micrococcus luteus ATCC-398 0,5 a Mycobacterium smegmatis s a ATCC-607 •z Mycobacterium tuberculosis H37R, 10 b Escherichia coli NIH J JC-2 Escherichia coli > 100 a (mely rezisztens streptomicinnel, kanamicinnel, klóramfenikollal és > 100 a tetraciklínekkel szemben) Klebsiella pneumoniae GN-6445 > 100 a Proteus vulgaris GN-75 > 100 a Pseudomonas aeruginosa IFO- 3756 > 100 c Pénicillium citrinum ATCC-9849 > 100 c Aspergillus fumigatus NI-5561 > 100 c Alternaria kikuchiana CBS > 100 c Ophiobolus miyabeanus ITO 50 c Nocardia asteroides 5 d Candida albicans 50 d A baktériumölési spektrumból látható, hogy az 5057B antibiotikum különösen hatékony baktériumölő a Gram-pozitiv mikroorganizmusok esetében. (12) LD50 A toxicitási vizsgálatot egereken végeztük. Az LDS0 érték intraperitoneális beadáskor 5.0 mg/kg és orális beadáskor nem kevesebb mint 500 mg/kg. Az alábbiakban megadjuk az 5057A és 5057 B antibiotikumok nátriumsóinak olvadáspontjait, fajlagos forgatóképességeit és szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás Rr értékeit. 5057A nátriumsója 5057 B nátriumsója Olvadáspont*C 133 135 143 145 Fajlagos + 1.0 5.5 forgatöképesség (c= I.MeOH) (c — 1.Cl ICI,) R, érték (1) rendszerben 0.56 0.62 R, érték (2) rendszerben 0.28 0.37 Az oldószer rendszerek: (1) n-hexán és elil-acetát (1:2) arányú elegye (2) benzol és elil-acetát (1:1) arányú elegye. Az 5057B antibiotikum így baktériumölő hatóanyagként hasznosítható, mert a vizsgálatok igazolták baktériumölő hatékonyságát. A találmány megvalósítása során legjobbnak talált módszert az alábbi példa szemlélteti: Tápközegei készítünk, amelynek pll-ja 6,0 és amely tartalmaz 6"„ oldható keményítőt. 2.5",, szójabab lisztet. 0,5"„ söréleszlöl. 0.5",, kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,3",, ammónium-szullVitot és 0.3",, kalcium-karbonátot. I liternyi tápközegbe inokulálunk Streptomyces sp. 505? törzsei (PERM BP-62) és 48 órán át 30 °C hőmérsékleten tenyésztjük. Az így kapott tenyészetet tartalmazó tápközeget inokuláljuk egyező összetételű 100 I lápközegbe, és keverés közben, levegőztetést alkalmazva 200 literes fermenlorban folytatjuk a tenyésztést 30 °C hőmérsékleten, 96 órán át. A levegőztetés intenzitása 100 liter/perc, a keverő fordulatszáma 250/perc. A lápközeghez ezután szűrést elősegítő anyagot (Radiolile 700. a Showa Chemical Industry Co. védjegye) adunk, majd szűréssel elkülönítjük a szürletel és a sejteket. A szürlelet 40 liter elil-acetáttál extraháljuk, a sejteket 30 liter acetonnal. A sejtek acetonos extraklumát csökkentett nyomáson bepároljuk az. acélon eltávolítása céljából, majd 20 liter etil-acetáttal extraháljuk. A kapott extrák Illírtől egyesítjük az előbbiek szerint kapott szőriét exlraklummal és az. elegyel csökkenteti nyomáson bepároljuk. A maradékot 200 g aktiv alumíniumoxidot tartalmazó oszlopon ctil-acetátot alkalmazva adszorbeáljuk és az. oszlopon álbocsálunk I: I arányú etil-aeetát elanol elegyet. Az aktiv frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így nyers kristályok alakjában az 5057A és 5057B antibiotikumok elegyél kapjuk. A kapott elegyel n-hexán és etil-acelát 1:2 arányú elegyénck alkalmazásával 500 g szilikagélt tartalmazó oszlopon adszoibeáljuk és ugyanezen oldatot bocsátjuk ál az oszlopon. A kapott frakciókat vékonyrétegkromalográliának vetjük alá, szilikagél-réteget és 1:2 arányban n-hexánt és etil-acetátot tartalmazó futtató elegyet alkalmazva. Csak azokat azcluált frakciókat különítjük el, amelyek az. 5057B antibiotikumot tartalmazzák, ezeket csökkentett nyomáson bepároljuk. (Az 5057A antibiotikumot akkor eluáljuk, amikor már befejeztük az. 5057B antibiotikum eluálásál.) A maradékot elil-aectálban feloldjuk, hígítóit sósavval kirázzuk, majd az elil-acetátos fázist hígítóit nátrium-karbonát oldattal kirázzuk. Az elil-acelátos fázist ezután csökkentett nyomáson bepároljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
