188081. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklopeptidek és az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 188 081 2 gat% trifluorecetsavat, 10 térfogat”/vizet és 1 térfogat”// tioglikolsavat tartalmazó elegyben, az oldatot azonnal 25 °C-ra melegítjük, és a terméket 50 perc múlva ezen a hőmérsékleten 15 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk, A végtermék kapott, nyers trifluoracetátját leszűrjük, vákuumban megszárítjuk, 5 ml n ecetsav-oldatban feloldjuk és 15 ml anioncserélőn, például acetát formában levő AG 1-X8 ioncserélőn (gyártja Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, Amerikai Egyesült Államok) átszűrjük. Az eluátumot vákuumban bepároljuk, a maradékot 230-lépcsős ellenáramú megosztásnak vetjük alá n-butanol-ecetsav-víz rendszerben (4: 1 : 5). A 230-274 fokozatokban található fázisokat (K=13,7) összegyűjtjük, vákuumban bepároljuk és 1 : 1 arányú terc-butanol-víz elegyből liofilizáljuk. A kapott, címben szereplő vegyületet vékonyrétegkromatográfiásan, három rendszerben vizsgálva egységes: DC: 52 számú rendszer: Rr=0,50, 111B számú rendszer: Rr=0,45, 157F számú rendszer: Rf=0,55. A kiindulási anyagként alkalmazott peptideket az alábbi módon állítjuk elő. 5.1 lépés Z-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[d 1 -/?-( 1 -naftil)]Gaba-OBz 1 411 mg Z-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-OH (11.5 lépés, a fentiekben megadott európai szabadalmi bejelentés 11. példája) és 172 mg dl-4-amino-3-(l-naftil)-vajsav-benzilészter-p-toluolszulfonát (2.1 lépés) 3 ml dimetilformamiddal készített elegyét összekeverjük 0,039 ml N-metil-morfolinnal, 47 mg N-hidroxi-benztriazollal és 85 mg N,N'-diciklohexil-karbodiimiddel, és az elegyet 20 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az elegy feldolgozása céljából a kivált diciklohexil-karbamidot centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszót 10 ml vízzel elkeverjük és a terméket leszűrjük. A kapott szilárd anyagot további tisztítás céljából 10 percen át 2 ml metanollal keverjük, a szuszpenziót 0 °C-ra lehűtjük, a tiszta terméket leszűrjük és vákuumban megszárítjuk. DC: [kloroform-metanol (85 : 15)]: Rr=0,67, [kloroform-metanol-víz (14 : 6 : 1)]: Rf=0,87. 5.2 lépés H-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)-Thr( But)-Phe-[d 1 -ß-( 1 -naftil)]Gaba-OH 421 mg Z-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)Thr(But)-Phe-[dl-/?-(l-naftil)]Gaba-OBzl (5.1 lépés) 15 ml dimetilformamiddal készített oldatát 50 mg, aktív szénre felvitt palládium (10%) beadagolása után 4 órán keresztül szobahőmérsékleten és normál nyomáson hidrogénezzük. Az elegy feldolgozása céljából az oldatot a katalizátor kiszűrése után nagy vákuumban 2 ml-re betöményítjük, a terméket 40 ml peroxidmentes éterrel kicsapjuk, leszűrjük és vákuumban megszántjuk. A nyersterméket további tisztítás nélkül használjuk fel a következő, 5.3 lépéshez (ciklizálás). 5 5.3 lépés EAsn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[/M 1 -naftil)]Gaba 357 mg nyers H-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[d 1 -/?-( 1 -naftil)]Gaba-OH (5.2 lépés) 355 mg N-hidroxi-benztriazol és 543 mg N,N’-diciklohexil-karbodiimid 260 ml dimetilfor- 15 mamiddal készített oldatát 20 órán keresztül 50 °C hőmérsékleten tartjuk. Feldolgozás céljából az oldószert nagy vákuumban körülbelül 30 °C hőmérsékleten lepároljuk, és a maradékot 20 ml etilacetáttal eldörzsöljük. A kivált diciklohexil-karbami- 20 dot szűréssel eltávolítjuk, a szürletet etilacetáttal 200 ml-re felhígítjuk, három alkalommal, 50-50 ml n vizes oxálsav-oldattal, majd vízzel semlegesre mossuk, nátriumszulfát felett megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. A nyersterméket tisztítás cél- 25 jából 480-Iépcsős ellenáramú megosztásnak vetjük alá metanol-viz-kloroform-széntetraklorid rendszerben (2700 : 675 : 900 : 1575 térfogatrész). A 75-114 fokozatokban található fázisok (K = 0,24) tartalmazzák a két diasztereomer egyi- 3q két (A izomer), a 161-186 fokozatokban található fázisok (K = 0,50) pedig a másikat (B izomer). A megfelelő fokozatok fázisait egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot 20 ml tercbutanolban feloldjuk és liofilizáljuk, így mindig 35 egy, a fenti összegképletű, vékonyrétegkromatográfiásan egységes diasztereömert kapunk. DC: [kloroform-metanol (85 : 15)]: A izomer: Rr=0,54, B izomer: Rf=0,45, [kloroform-metanol-víz (14 : 6 : 1)]: 43 A izomer: Rf=0,90, B izomer: Rf=0,85. 6. példa 45 l— Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-[/?-(4-klór- l-naftil)]Gaba " - B izomer 178 mg CAsn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boc)-Thr(BuO-Phe-[/M4-klór-lnafti!)]Gaba — t)ü J-V- B izomer képletű védett oktapeptidet az l.B példában leírt módon dolgozzuk fel. A termék tisztítását 770-lépcsős ellenáramú megosztással végezzük terc-buta„ nol-toluol-metanol-puffer rendszerben 55 (800 : 800 : 340 : 1140), a puffer 1 liter vízben 2,2 g ammóniumacetátot és 1,6 ml jégecetet tartalmaz. A tiszta B izomert tartalmazó fázisokat (K = 1,1) vákuumban bepároljuk, és a maradékot terc-butanol és víz elegyéből liofilizáljuk. 60 DC: 52 számú rendszerben: Rf=0,46, 157C számú rendszerben: Rf=0,24. # Hasonlóképpen eljárva állítjuk elő az L Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys-Thr-Phe-[/?-(4-nitrofenil)]Gaba -I 65 - B izomer 14
