188077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az új antibiotikus hatású BMG162-AF2 előállítására
1 188 077 2 33 g aktív szenet adunk az aktív komponens adszorbeálása céljából. Az aktív szén vizes mosása után a BMG162-aF2 antibiotikumot 500 ml 0,05 n, 80% metanolt tartalmazó vízzel készült sósavoldattal eluáljuk. Az eluátumot a Rohm and Haas cég által Amberlite IR-45 márkanév alatt forgalmazott, OH -formájú gyantával semlegesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk, 305 mg mennyiségben BMG162-aF2-hidrokloridot kapva. Az I. frakciót (amely tartalmaz olyan anyagot, mely 280 nm-en adszorbeál) szárazra pároljuk, majd a maradékot metanollal extraháljuk és ezután 1 liter ionmentesített vízben oldjuk. A kapott oldatot olyan 400 ml-es és 4,3 cm átmérőjű oszlopon újrakromatografáljuk, amely CM-Sephadex C-25 gyantával van töltve. Gradiens-eluálást végzünk összesen 4 liter, 0 és 1 mól közötti koncentrációjú nátriumklorid-oldattal. Az aktív frakciókat szárazra pároljuk, majd metanollal extraháljuk és az extraktumot olyan 780 ml-es 2,8 cm átmérőjű oszlopra visszük fel, amely Sephadex LH-20 gyantával van töltve. Az oszlopot metanollal eluáljuk a terméknek nátrium-kloridtól való megtisztítása céljából. Az eluátum bepárlásakor 670 mg mennyiségben kapunk tiszta BMG162-aF2-hidrokloridot. Az összhozam tehát 975 mg BMG162-aF2-hidroklorid. 3. példa A 2. példában kapott BMG162-aF2-hidrokloridból 150 mg 1 ml metanollal készült oldatához hozzáadunk 1 ml, pikrinsawal telített metanolt, majd az így kapott keveréket forrásig melegítjük. Bepárlás után a maradékot benzollal és etanollal mossuk a fölös pikrinsav eltávolítása céljából. Víz és etanol elegyéből végzett kristályosítás után kristályos alakban BMG162-aF2-pikrátot kapunk. 4. példa Injektálható készítmény Az 1. példában ismertetett módon előállított BMG162-aF2-hidrokloridból 30 súlyrészt feloldunk 970 ml súlyrész tisztított vízben, majd a kapott oldatot csíramentesre szűrjük GS-típusú Millipore szűrőn. A szűrletet 10 ml-es fiolákba töltjük és liofilizáljuk, fiolánként 30 mg fagyasztva szárított BMG162-aF2-hidrokloridot tartalmazó injektálható készítményt kapva. 5. példa Szemcsés készítmény 50 súlyrész, az 1. példában ismertetett módon előállított BMG162-aF2-hidrokloridot, 600 súlyrész laktózt, 330 súlyrész kristályos cellulózt és 20 súlyrész hiroxi-propil-cellulózt alaposan összekeverünk, majd a kapott keveréket Roller-Compactor márkanevű forgó sajtóiéban sajtoljuk és szemcsésre törjük, a körülbelül 1 mm és 0,25 mm közötti lyukméretű szitákon áteső frakciót elkülönítve. 6. példa Tabletta 30 súlyrész, az 1. példában ismertetett módon előállított BMG162-aF2-hidrokloridot, 20 súlyrész kristályos laktózt, 147 súlyrész kristályos cellulózt és 3 súlyrész magnézium-sztearátot V-alakú keverőt használva összekeverünk, majd tablettázunk. 7. példa Az 1. példában ismertetett módon a Bacillus laterosporus OUT 8139 standard tenyészetével 4,4 liter mennyiségű tenyészet-szűrletet készítünk. Tekintettel arra, hogy ez a törzs a BMG162-aF2 antibiotikum mellett olajban oldható antibiotikumokat is termel, az először említett antibiotikumot a következőképpen különítjük el, illetve tisztítjuk. Az emlitett tenyészet-szűrletet felvisszük egy olyan oszlopra, amely a Rohm and Haas Co. amerikai egyesült államokbeli cég által Amberlite IRC-50 márkanéven forgalmazott, Na+-formájú gyantából 310 ml-t tartalmaz. Ezután az oszlopot vízzel mossuk, majd a hatóanyagot 0,5 normál sósavoldattal eluáljuk. Az aktív frakciókat (vagyis azokat a frakciókat, amelyek antimikrobiális hatást mutatnak Bacillus subtilis PCI 219 törzzsel szemben) összegyűjtjük, majd a kapott 1480 ml oldatot először 1 normál nátrium-hidroxid-oldattal semlegesítjük és ezután 4,4 g aktívszénnel elegyítjük. A kapott keveréket 30 percen át állni hagyjuk, majd az aktívszént kiszűrjük. Az aktívszént 30 ml 50 térfogat%-os vizes acetonnal keverjük a hatóanyag 2,0 pH-értéken történő extrahálására. Ugyanezt az extrakciós műveletet még kétszer megismételjük. Az extraktumokat összegyűjtjük, majd csökkentett nyomáson 45 ml térfogatra betöményítjük. A koncentrátum pH-értékét 7,8-re beállítjuk, majd 45 ml n-butanolt keverünk hozzá és rázás közben extrahálásnak vetjük alá. A vizes fázist elválasztjuk, pH-értékét 5-re beállítjuk és vízzel elegyítjük, hogy 200 ml térfogatú oldatot kapjunk. Az oldatot fel visszük egy olyan oszlopra, amely a Pharmacia Fine Chemicals svéd cég által CM-Sephadex C 25 márkanevű gyantából 100 ml-t tartalmaz Na+-formában. Az oszlopot vízzel mossuk, majd gradiens eluálásnak vetjük alá 0 és 1,2 mól között lineárisan növekvő koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal. Az eluálódott aktív frakciókat összegyűjtjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk, fehér port kapva. Ezt azután metanollal extraháljuk, majd a metanolos oldatot felvisszük egy olyan oszlopra, amely az említett svéd cég Sephadex 2LH-20 márkanevű gyantájából 55 ml-t tartalmaz metanolban szuszpendálva. Az oszlopot metanollal eluáljuk. A kapott aktív frakciókat összegyűjtjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk, 5,8 mg mennyiségben fehér színű viszkózus anyagot kapva. Ez az anyag ugyanolyan HNMR- és infravörös spektrumú, mint a BMG162- aF2. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
