188057. lajstromszámú szabadalom • Antigén-antitest reakciós analitikai eljárás és ahhoz alkalmazható reagens
1 188 057 2 általában ne haladja meg az 5 súlyszázalékot, előnyösen a koncentráció 0,001 és 0,5 s% közötti. Ha a koncentráció nagyobb, egyes meghatározó rendszerekben instabillá válhat a reakció. Ha viszont a koncentráció kisebb, csökken az inhibitáló hatás az ún. nem-specifikus reakciókkal szemben, melyeknek a meghatározást zavaró hatása miatt nem érhető el a megkívánt meghatározási pontosság, mert megnő viszont az olyan inhibitáló hatás, melyet a szérum mintában fellépő, a megfelelő antigénnel való reakciótól eltérő hatások okoznak, s így a meghatározás pontossága romlik. Az antigének, melyek a meghatározandó anyagot vagy a reagenst alkotják, különfélék lehetnek, pl. proteinek, polipeptidek, szteroidok, poliszacharidok, lipidek, virágporok, porok, haptének. Antitest lehet pl. olyan protein, mely az említett antigének valamelyikének antiteste. Az antigén-antitest reakció találmány szerinti meghatározását a technika állásából jól ismert bármely meghatározó rendszerben végezhetjük. így pl. alkalmazhatjuk a találmányt az ún. oldatrendszerekben, melyeknél mind a meghatározandó anyag, mind a reagens oldódik a reakcióközegben, s úgyszintén az ún. hordozó rendszerekben, melyeknél a reagenst valamely - a reakcióközegben gyakorlatilag nem oldódó - szemcsés vivőanyag hordozza, vagyis a szemcsés hordozót a reagenssel szenzibilizáljuk. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával elemezhető antigén-antitest reakciók tipikus példái azok a reakciók, melyek a radioimmunassay, az infravörösközeli turbidimetriával végzett látex agglutinációs teszt az enzimimmunassay, a fluorimmunassay, a fényszóródás jelenségének hasznosításával végzett immunnefelometria, a vörösvérsejt agglutinációs, a látex agglutinációs és hasonló tesztek során fordulnak elő. Különösen előnyösen alkalmazható a találmány szerinti eljárás az olyan meghatározó rendszerekben, amilyen pl. az infravörösközeli turbidimetriával végzett látex agglutinációs teszt, ahol pl. hasznosíthatják a visszafordított passzív agglutinációt. Már említettük, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmazásával elkerülhetők olyan nem-specifikus reakciók, amelyek antigén-antitest reakciók kísérőjelenségeként egyébként előfordulnak és ennek köszönhetően pontosabb lesz a meghatározás. A találmány szerinti eljárást néhány példával is szemléltetjük, amelyekre azonban találmányunk nem korlátozódik. A példákban szereplő százalékértékek mindig súlyszázalékok. 1. példa Ez a példa az infravörösközeli turbidimetriával végzett látex agglutinációs tesztet szemlélteti. Vizsgáló oldatot készítünk oly módon, hogy 2 ng/ml-t meg nem haladó mértékben a,-fetoproteint (AFP) tartalmazó 50 pl normál humán szérumhoz adunk 1 pg/ml AFP-t tartalmazó 50 pl oldatot és marhaszérumalbumin fiziológiás sósvizes oldatából 100 pl-t, amely utóbbi 0,6%-nyi dextrán-szulfátot is tartalmaz. 50 pl vizsgáló oldathoz 50 pl látex reagenst adunk (részecskeméret 0,22 pm, gyártó: Dow Chemical Co.), amelyet anti-AFP antitesttel szenzibilizáltunk, továbbá 200 pl pufferoldatot [0,1 mól/liter glicin puffer, pH = 8,8], A zavarosság változását turbidimetriával mérjük keverés közben infravörösközeli, 940 nm hullámhosszúságú fénysugár alkalmazásával. A mintára kapott mérési értékeket felvisszük szórásgörbére, a kinyert hatóanyag mennyiségét számítjuk. Az eredményeket Táblázatban foglaljuk össze, amelyben azokat ellenőrzésképpen összehasonlítjuk olyan reakciórendszer eredményeivel, mely polianiont nem tartalmaz. A Táblázatból látható, hogy számottevően javult a kinyerés (P < 0,01 ), amikor dextrán-szulfátot adtunk a reakcióközeghez (végkoncentráció 0,1%) és jelentős mértékben javult a variancia tényező (CV) is. Az egyes kísérletekben elért hatóanyag kinyerést relatív értékként adjuk meg, melyet úgy kapunk, hogy a kinyerési értékeket normáljuk, amennyiben a tíz tiszta, zavarosságmentes minta egyesített szérumával kapott kinyerést tekintjük 100%-nak. 2. példa Az 1. példa szerint járunk el azzal az eltéréssel, hogy polianionként polisztirol-szulfonsavat alkalmazunk 0,2%-os végkoncentrációban. Az így kapott eredményeket is trtalmazza a Táblázat és látható, hogy a variancia tényező mértékében javulás mutatkozik. 3. példa Az 1. példa szerint járunk el azzal az eltéréssel, hogy polianionként heparint alkalmazunk 0,1%-os végkoncentrációban. A Táblázatban megadott értékek a kinyerés javulását mutatják. 4. példa Az 1. példa szerint járunk el azzal az eltérései, hogy polianionként cellulóz-flalál-acetátot alkalmazunk 0,1%-os végkoncentrációban. A Táblázatból látható, hogy a kinyerés javul. 5. példa Ez a példa azt szemlélteti, milyen hatással van az oldathoz adott dextrán-szulfát a vörösvérsejt agglutinációra, mely folyamat kísérőjelenségeként egyes minták esetében pszeudo-reakciók léphetnek fel, melyek meghamisítják a meghatározás értékeit. AFP tartalmú mintát hússzorosan hígítunk dextrán-szulfátot tartalmazó foszfátos pufferoldattal (pH = 6,4) oly módon, hogy a dextrán-szulfát végkoncentrációja 0,001% legyen. Az így hígított mintából 100 pl-nyit adunk anti-AFP antitesttel szenzibilizált birka-vörösvérsejt szuszpenzióhoz. Az elegye! 2 órán át állni hagyjuk. Az 50 ng/ml-t meg nem 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
