187793. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kutyák szopornyicája elleni attenuált elővírusos vakcina előállítására sejttenyészetben
3 187 793 4 tataikban a vírus elszaporodását specifikus cytopatho-' gén hatás kísérte. Bussei és Karzon későbbi vizsgálataikban megállapították, hogy a szövethez szoktatott Onderstepoort törzs később kevésbé képes a chorioallantois membránon léziók kiváltására. Paganini és Papparella; Acta Med. Vet. Napoli, 1960. 6. 253., hasonló eredménnyel szaporított el avianizált szopornyica vírustörzset csibeembrió-fibroblaszt sejttenyészetben. Vasic. B., Vasic N. Lukic és Kristie (1976) szintén az Onderstepoort törzset szaporították el csirkeembrió-fibroblaszt sejttenyészetben. Vizsgálatainkban a vírus szaporodását cytopathogén hatás nem követte, a vírus szaporodását chorioallantois membránra történő visszaoltással igazolták. A szopornyica vírustörzsek sejttenyészetben való szaporítását illetően ellentmondásosak az irodalmi adatok. A virulens szopornyica vírustörzseket némely esetben sikerült sejttenyészetben elszaporítani, és a vírus szaporodását egyes esetekben sejtkárosító hatás is kísérte. A szopornyica elleni vakcinatermelésre használt vírustörzsek közül az Onderstepoort vírustörzset sikerült egyes szerzőknek szövcttenyészelbcn elszaporítauia. Az esetek egy részében a vírus szaporodását specifikus cytopathogén hatás is kísérte, de az így szaporított vírus később kevésbé képes chorioallantois membránon léziók kiváltására. Mások szerint a sejttenyészetben szaporított Onderstepoort vírustörzsnek nincs cytopathogén hatása és a vírus szaporodás csak choriallantois memb-.j ránra történő visszaoltással igazolható. A sejttenyészetben szaporítható virulens szopornyica vírusok élővírusos vakcina előállítására a betegség terjedése, illetve fennmaradása miatt nem használhatók fel. A vakcinatermelésre használt vírusok sejttenyészetben is szaporítható törzseinek általában nincs sejtkárosító hatása és a vírusszaporodás, illetve a vírustiter ellenőrzése csak bonyolult és munkaigényes módszerekkel (például a Rockborm törzs esetében immunfluoreszcenciás módszer) végezhető el. A találmány célja, hogy egyszerű eljárást biztosítson szopornyica elleni védettséget adó, sejttenyészetben szaporított, modifikált élővírusos vakcina előállítására. Vizsgálatainkban a Behringwerke A. G. által rendelkezésünkre bocsátott csirkeembrióhoz adaptált, Lederle-féle szopornyica vírustörzset használtuk. A vírus csirkeembrió chorioallantois membránján szaporodott és sejttenyészetben cythopathogén hatást nem mutatott. Kísérleteink során 11 napos csirkeembrióból; tripszines emésztéssel fibrobiaszt-tenyészeteket készítettünk. A tenyésztéshez 0,5 % lactalbumin hidrolizátumot, 10% tyúkvérsavót, vagy 10 % borjúvérsavót, 100 E/ml penicillint, 50/ag/ml streptomycint használtunk. Felhasználás előtt a tápfolyadékot leöntöttük és fenntartó folyadékként 1 % tyúksavót, illetve 1 % borjúsavót tartalmazó Hanks oldat és amnionfolyadék azonos mennyiségű keverékét alkalmaztunk. Az avianizált Lederle-féle vírust hetente passzáltuk a leírt fibroblaszt tenyészeten. A tenyésztőedényeket 37 °C-on tartottuk és naponta vizsgáltuk. A vírussal való oltást követő 7. napon a tenyészetek fenntartó folyadékát sterilen leszívtuk és a learatott folyadékot továbboltottuk. Az első 4 passzázsban cytopathogén hatásra utaló elválasztásokat nem találtunk. Az 5. passzázsnál a tyúksavós tenyészet sejtjei a 4. napon gócokban zsugorodtak. Az 5. napon a tenyészet a fókuszok körül kezdett felszakadozni és a 6.-7. napra hálózatos szerkezetűvé vált. A kontroll tenyészetek ugyanakkor teljesen épek maradták. A vírusnak ez a szövetkárosító hatása a további passzázsokban következetesen megfigyelhető volt. Az 5. napos tenyészetek szövettani vizsgálata során többmagvú óriássejteket találtunk, míg a 6.-7. napos tenyészeteket syntjtiumos, hálózatos szerkezet és az óriássejtek számának csökkenése jellemezte. A borjúsavós tenyészetekben csak a 10. passzázsnál észleltünk sejtkárosító hatást. A sejtkárosító hatás szopornyica vírustól való eredetének igazolására vírusneutralizációs próbát végeztünk chorioallantois membránon és szövettenyészetben. A 10. passzázs 103,33 1D50 és 102,25 TC1DS0 titerű vírusát az l:10-es hígításéi szopornyica elleni szérum közömbösítette. A 10. passzázsban a 7. napon learatott vírust centrifugáltuk és azonos menynyiségű 3 súlyrész lósavót, 1 súlyrész húslevest, valamint 7,5 % glükózt tartalmazó védőkolloid hozzáadásával liofilizáltuk. A vírus további passzázsaiban a sejttenyészetek előállításához szükséges lápfolyadékot és a vírus liofilizálásához szükséges védőkolloidot mind összetevőiben, mind arányaiban módosítottuk a vírustiter növelése, illetve megóvása céljából. A találmány szerinti eljárásban a Lederle-féle avianizált szopornyica vírustörzs sejttenyészetben szaporított 32. passzázsát alkalmazzuk vakcinatermelésre. A vírusszaporításra alkalmas sejttenyészeteket (primer vagy secunder csirkeembrió-fibroblaszt) 10% triptózfoszfát levest, 4 % borjúsavót és 86 % Parker 199-et tartalmazó tápfolyadék alkalmazásával állítjuk elő. A minimálisan 103 TCID5o/0,2 ml titerű szövetoltó vírustörzsanyagot —196 °C-on vagy liofilizált állapotban -20 °C-on tároljuk. A vakcinatermelés céljára előállított szövettenyészeteket a szövetoltó vírustörzsanyag sejttenyészetben készült 1. passzázsával fertőzzük és az inkubációs idő eltelte után megfelelő védőkolloid hozzáadásával liofilizáljuk. Az ily módon előállított vakcina 3 hónapos vagy ennél idősebb kutyák szopornyica elleni aktív immunizálására alkalmas. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott vírustörzs cytopathogén hatással rendelkezik, emiatt a vírusszaporodás a sejttenyészetben fénymikroszkópos vizsgálattal nyomon követhető. A vírus a sorozatpasszázsok során megtartotta jó antigén hatását és nem veszítette el a csirkeembrió chorioallantois membránjára való pathogenitását sem. A vírusértékmérés ily módon sejttenyészetben és chorioallantois membránra történő oltással egyaránt elvégezhető. Sok egyéb, sejttenyészetben szaporított szopornyica vírustörzs esetében a vírustitrálás csak a bonyolult és költséges immunfluoreszcenciás eljárással vagy csak kizárólagosan chorioallantois membránra történő visszaoltással végezhető el. A vírustörzs csirkeembriófibroblaszt sejttenyészeten szaporodik, amely bármelyik szövettenyésztő laboratóriumban rendkívül könnyen, rutinszerűen előállítható. Sok helyütt a szopornyica vírusokat primer menyét- vagy görényvese sejttenyészetben, máshol Verő sejteken szaporítják. Számos országban, így hazánkban is a szopor-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
