187616. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szaporodás-biológiai hormonmeghatározásokhoz alkalmas tejminta készítésére, állattenyésztési célokra
1-187 616' 2 rális mosószer. A mosófolyadék általában a mosószernek 1-3%-os vizes oldata. Ebbe a mosóoldatba helyezzük a kívánt méretre vágott szűrőpapírokat, a mosóoldatban 1-2 órán át állni hagyjuk azokat, vagy semleges gáz átbuborékoltatásával gyengén keverjük. Ajánlatos a mosóoldat hőmérsékletét legalább 15-30 percig 40-50 C°-on tartani. Ezután a szűrőpapírról a mosófolyadékot leöntjük, és csapvíz áramoltatásával a mosószer-maradékot kimossuk. A csapvíz áramoltatását 1-2 órán szobahőmérsékleten végezzük. Ezt követően a csapvizet a szűrőpapírról leöntjük, majd a csapvízmaradványokat ionmentes vízzel történő 3-5-szöri átöblítéssel eltávolítjuk. E tisztítási műveletek után a szűrőpapírokat szobahőmérsékleten megszárítjuk. A hormon meghatározásokhoz a szűrőpapírnak a leírt módon történő előtisztítása után további szerves oldószeres kezelés általában nem szükséges. A találmányt a következőkben a példa kapcsán szemléltetjük közelebbről. Példa Tejmintát veszünk, még pedig úgy, hogy négy tőgynegyedből származó 1-5 ml kevert tejmintát 10-20 ml térfogatú kémcsőbe bocsátunk, majd öszszerázzuk. E kevert mintából mérőpipettával ismert térfogatban, 50-100 pl mennyiséget a rendelkezésre álló, borítékból kivett szűrőpapírra cseppentünk, és szobahőmérsékleten, erős fénytől (pl. napfény) óvott helyen hagyjuk beszáradni (30-40 perc). A beszárított folt mellett a tejminta eredetére vonatkozó kódszám grafitceruzával feltüntetve szerepel. A folt (egyetlen szűrőpapíron 10-20 minta) beszáradása után a szűrőpapírt két géppapír közé helyezzük, és visszatesszük a borítékba, majd postázzuk. A szűrőpapíron tejmintákat nem tartalmazó, legalább 5 foknyi felületet szabadon hagyunk, hogy minden szűrőpapírra a laboratórium saját referencia-mintáit a hormon meghatározás előtt felcseppenthesse. Az eljárás során nagy gondot fordítunk arra, hogy felcseppentéskor a szűrőpapírt tiszta felületre helyezzük, és a szűrőpapír kézfelülettel ne érintkezzék (csipeszt, esetleg cérna- vagy gumikesztyűt használunk). A laboratóriumba beérkezett levélküldeményben lévő szűrőpapírból a foltokat tiszta asztalfelületen kivágjuk, és kémcsőbe aprítjuk. A csövekbe a hormon fajtájától függő mennyiségű (általában 2,0 ml) eluens puffer oldatot mérünk. A csöveket 60 percig 60 °C-on (vagy hasonló időtartammal és hőmérsékleten) állni hagyjuk, utána szobahőmérsékleten rázógépen kb. 30 percig enyhén rázzuk. E kezelés folyamán a hormonok a szűrőpapírról leoldódnak. Oldás után a szűrőpapír-szeletek fölött lévő puffer oldatból két meghatározott térfogatnyi mennyiséget (pl. 0,4 ml) csövekbe pipettázunk, amelyben ismert módon elvégezzük az immunoassayt. A találmány szerinti minta készítési és transzportálási eljárás alkalmas valamennyi ismert immunoassay (radioimmunoassay, enzymimmunoassay stb.) alkalmazásával a szteroid hormonok meghatározására, tejmintákból. Az eddigi ismeretek szerint fejlett ipari állattenyésztő országokban a tejminta konzerválása a szállításhoz a feldolgozásig különböző kémiai adalékanyagok (pl. káliumbikromát, nátriumazid) kétes értékű alkalmazását, a nagy bomlásveszély miatt a minták hűtött állapotban történő szállítását, e célra külön személyzetet és jelentős anyagi ráfordítást igényel. Hazánkban a kérdés egyáltalán nem megoldott, annál inkább, mert a tej hormonanalízisét napjainkban kezdik alkalmazni, ennek azonban gátat szabhatnak a mintavétellel és a szállításával kapcsolatban felmerülő gondok. A találmány szerinti eljárás előnyei, hogy a) Szakképesítést nem igényel a mintavétel, a tejfolt felcseppentése a szűrőpapírra (csak a pipettakezelés elsajátítása és a tisztaság a kritérium). b) A szűrőpapíron beszárított tejminta konzerválószer alkalmazása nélkül transzportálható bomlás veszélye nélkül, tekintettel arra, hogy beszárított állapotban a mikrobiológiai és egyéb bomlásfolyamatok nem indulnak meg. Ellenőrző vizsgálatok szerint szteroid hormonok a szűrőpapíron beszárított tejfoltban szobahőmérsékleten legalább 30 napig bomlás veszélye nélkül tárolhatók. c) Hűtőkonténeres szállítás, és mélyhűtőben való tárolás szükségtelen. d) Személyzetet nem igénylő, gyors és egyszerű, rendkívül olcsó, borítékolt postai szállítással történhet a minták továbbítása. e) A szűrőpapírra szárított foltból a hormon oly módon oldódik ki vizes közegben (puffer oldat), hogy az immunoassayt zavaró kísérőanyagok (egyéb lipidek) a szűrőpapíron visszamaradnak. f) Az alkalmazott leoldás első fázisában, 60 °C- on (vagy ehhez hasonló hőmérsékleten) a tejben lévő fehérjék denaturálódnak, ily módon az assay folyamán a hormont már megkötni nem képesek (pl. hormont kötő globulinok, albumin stb.). Ez a körülmény megbízhatóbb hormonanalízist eredményez, mintha közvetlenül a tejből végeznénk a meghatározást. g) Eluensként puffer oldat alkalmazása esetén kioldás után az oldat kis térfogat mennyiségeiből direkt módszerrel (a tej szerves oldószeres extrakciója nélkül, elválasztás-technikai lépések alkalmazása nélkül) nyílik lehetőség. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás szaporodás-biológiai hormonmeghatározásokhoz alkalmas tejminta készítésére, állattenyésztési célokra, azzal jellemezve, hogy a tejmintát - adott esetben előtisztított - szűrőpapírra cseppentjük, beszárítjuk, és a hormonmeghatározás helyén a tejmintát tartalmazó szűrőpapírt a papír anyagát nem roncsoló, de a meghatározandó hormont oldó oldószer vizes oldatával, előnyösen puffer oldattal kezeljük, célszerűen enyhe melegítés közben. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldószert vizes oldat formájában alkalmazzuk, és az oldódás tökéletesebbé tételére 40-60 C° hőmérsékletet tartunk fenn. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
