187495. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a vérplazma VIII. faktorának stabilizálására és kinyerésének fokozására.
187 495 Találmányunk tárgya eljárás a vérplazma VIII. > faktorának stabilizálására és kinyerésének fokozá-. sára vérplazmából kalcium-só, előnyösen kalciumglükonát adagolásával - 30 °C-on végzett gyorsfagyasztás és ezt követő +4 °C-on végzett 5 * * * * felolvasztás után a VIII. faktor centrifugálásával, majd alkalmas oldószerben való feloldása utáni mélyfagy asztásával. A korszerű vérterápia lényege, hogy minden beteg, aki valamilyen okból vérpótlásra szorul, azt a 10 vérkomponenst kapja, amelyre szüksége van, hogy ne terhelje szervezetét olyan sejt-, vagy fehérjekomponensekkel, amelyek számára feleslegesek, viszont más betegek számára életfontosságúak lehetnek. A vérellátás ezt a feladatot a vér frakcionálá- 5 sával oldja meg. A vérplazma fehérjekomponensei közül világszerte a VIII. véralvadási faktor iránt a legnagyobb az érdeklődés, de a termelés nem tud lépést tartani a szükségletekkel. A VIII. faktor készítményeket a * veleszületetten vérzékeny (haemofília és Willebrand betegség) betegek kezelésére használják. A VIII. faktor előállítását az nehezíti meg, hogy a citrátos véralvadásgátlóba (továbbiakban CPD, összetétele: 2,6% nátriumcitrátot, 0,3% citromsa- 25 vat, 0,22% dinátriumhidrogénfoszfátot és 3,7% glükózt tartalmazó vizes oldat; vagy ACD, összetétele: 0,5% citromsavat, 2% nátriumcitrátot és 3,0% glükózt tartalmazó vizes oldat/Ievett vérben, illetve az ebből előállított vérplazmában rendkívül gyor- 30 san bomlik. Ha a vérplazmát +4 °C-on tárolják, a VIII. faktor aktivitása 24 óra alatt 50%-kal, 48 óra alatt 75%-kal csökken (Slichter, S. J. et al., Transfusion, 76,616, 1976; Milam, J. D. et al., Transfusion, 20, 546, 1980). 35 E veszteség elkerülése végett a plazmát a vérvételtől számítottan 4-6 órán belül - 30 °C-ra fagyasztják. A vért azonban a feldolgozás helyére kell szállítani, így a vérvételtől számított 4-6 órán belüli mélyfagyasztás általában nem oldható meg. 40 A vérplazma VIII. faktor előállítása CPD, vagy ACD antikoagulánsba vett vér centrifugálása után nyert plazmából történik, oly módon, hogy a plazmát - 30 °C-on mélyfagyasztják, majd + 4 °C-on 14-16 óra alatt felolvasztják, az így kapott csapa- 45 dék az ún. krioprecipitátum, VIII. faktorban és fibrinogénben dús csapadék. Ezt +4 °C-on elválasztják a felülúszó plazmától és terápiás célra mélyfagyasztva, illetve liofilizálva tárolják. A krioprecipitálási eljárás jelenleg a világon legelterjed- 50 tebb technológia a vérplazma VIII. faktorának előállítására, azonban a kitermelés optimális laboratóriumi körülmények között sem haladja meg a 40-50 %-ot, de üzemi körülmények között ennél alacsonyabb, általában 30%, (Prowse, C. V., 55 McGill, A., Vox Sang., 37,235, 1979). Bár heparinba vett vérből fenti módszerrel a VIII. faktor kitermelést megjavították 78%-ra (Rock és mtsai Vox Sang., 36, 294, 1979), azonban ez a módszer a gyakorlatban nem volt alkalmazható, mert a vér- 60 plazma további frakcionálását és a többi értékes vérfehérje előállítását rendkívül megnehezítette a bevitt heparin, igen bonyolult műveletek szükségesek ahhoz, hogy az alakos elemek konzerválásához és a fehérjefrakcionáláshoz utólag megfelelő CPD 65 koncentrációt lehessen biztosítani (Smit Sibinga C. T. et al., Lancet, I. 449, 1981). Célkitűzésünk az volt, hogy a vérkonzerválásban általánosan használt CPD antikoaguláns alkalmazásával olyan eljárást dolgozzunk ki, amellyel a vérplazma VIII. faktora +4 °C-on napokig stabilizálható, valamint a plazmából történő kinyerés hatásfoka emelhető. A kísérleteket a vérkonzerválásban szokásos módon steril körülmények között zárt rendszerben végeztük. A vért CPD antikoagulánsba vettük le, majd centrifugáltuk, a nyert plazmákat öszekevertük és kétfelé osztottuk, az egyik adag volt a kontroll, a másik plazma adagot különböző kezelésnek vetettük alá. Meglepő módon azt találtuk, hogy a plazmához kalciumsókat adagolva a VIII. faktor stabilitása nagymértékben növekedett. A legjobb eredményt kalciumglükonát adagolásával értük el. A vérplazma kalciumkoncentrációt 2,5-4,5 mMól értékre beállítva optimális stabilizálást kaptunk: + 4 °C-on történő tárolásnál még 96 óra után is csak 25%-kai csökkent a VIII. faktor aktivitás, míg a kezeletlen kontroliban ugyanebben az időpontban az aktivitáscsökkenés 75% volt. Kísérleti eredményeinket az I. sz. Táblázatban foglaltuk össze. 7. Táblázat VIII. faktor stabilitás +4 °C-on tárolt plazmában. Tárolás időtartama (óra) 0 12 24 48 72 96 Kezeletlen kontroll+ VIII. faktor E/ml 1,1 0,65 0,65 0,5 0,5 0,3 VIII. faktor veszteség 0 órás érték százalékában___________- 41,0 41,0 55,0 55,0 73,0 Kalciumglükonáttal kezelt minta** VIII. faktor E/ml 1,1 1,1 1,1 1,0 1,0 0,85 VIII. faktor veszteség 0 órás érték százalékában___________- 0,0 0,0 10,0 10,0 23,0 +: 5 kísérlet átlaga, 28 vérvételből ++: 5 kísérlet átlaga, 20 vérvételből A VIII. faktor aktivitást a Haemostasis 7, 1 (1978)-ban leírt módszer szerint határoztuk meg. A kalciumglükonátot a plazma térfogatára számítottan 0,14 s%-nyi mennyiségben alkalmaztuk. További kísérleteinkben kimutattuk, hogy a stabilitási kísérletekben alkalmazott plazma kalciumkoncentráció biztosításával az eddig ismert technológiai megoldásokhoz képest lényegesen magasabb, 72-90 %-os kitermeléssel volt kinyerhető a plazmából a VIII. faktor. Ez a magas kitermelés meglepő módon a VIII. faktor aktivitásának mértékétől függetlennek mutatkozott. Kísérleti eredményeinket a 2. Táblázatban foglaltuk össze. 2
