187390. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-oxo-delta1,4-szteroid-származékok előállítására
A találmány tárgya eljárás 3-oxo-AM-szteroidszármazékok előállítására. Az eljárásra jellemző, hogy 1,2-helyzetben telített 3-oxo-A4-szteroid-szár-. mazékokat egy Arthrobacter simplex mikroorganizmus-törzs élő tenyészetével fermentálunk, mimellett a fermentációs közeg literenként 0,04 g-0,12 g kobalt(II)-iont tartalmaz. A 3-oxo-A4-szteroidoknak az ismert szteroid-A1- dehidrogénező mikroorganizmusok (mint például Bacillus lentus ATCC 13 805, Bacillus sphaericus ATCC 7054, ATCC 7055 és ATCC 12 488, Bacillus subtilis NRRL B 558, Arthrobacter simplex, valamint Norcardia corallina ATCC 4273 és ATCC 4275) élő tenyészetével végzett fermentációja igen gyakran nem biztosit kielégítő eredményt. Részben azért, mert aza átalakulás sebessége túlságosan alacsony, illetve a szubsztrátum átalakulása nem kielégítő, részben a szubsztrátum nagymértékű metabolizációja miatt. Azt találtuk, hogy a 3-oxo-A4-szteroidok mikrobiológiai úton végzett A1 -dehidrogénezését igen jó eredménnyel meg lehet valósítani, ha az említett szubsztrátumok dehidrogénezését az Arthrobacter simplex mikroorganizmus-fajtához tartozó törzssel végezzük és a mikrobiológiai átalakítást a fermentációs közeg egy literjére számítva 0,04 g-0,12 g kobalt(II)ion jelenlétében folytatjuk le. Az alkalmas Arthrobacter simplex törzsek közé tartozik például az IFO (3530), az ATCC 13 260, de különösen az ATCC 6946 számon nyilvántartott törzs. Meglehetősen régóta ismert dolog, hogy az Arthrobacter simplex - melyet korábban Corynebacterium simplex-nek neveztek - szteroidok A'-dehidrogénezésére képes mikroorganizmus. Ezt a baktériumfajtát gyakran használják az iparban, mert az előbbiekben felsorolt egyéb szteroid-A1 -dehidrogénező mikroorganizmusokkal szemben az Arthrobacter simplex alkalmazása azzal az előnnyel jár, hogy az átalakítás lényegesen gyorsabban megy vele, mint a többi mikroorganizmussal. Másfelől azonban az Arthrobacter simplex alkalmazása az alábbi két hátránnyal jár: 1, Hosszabb fermentációs idő esetén a mikroorganizmus gyakran hajlamossá válik a szteroidok metabolizálására, ami a kívánt termék tekintetében jelentős kitermelési veszteséget okozhat, továbbá 2. hajlamos arra is, hogy a reakciót leállítja amikor még 1-3% kiindulási szteroidvegyület van a fermentlében. Ez - gyakran jelentős mértékben - megnehezíti a terméknek a gyógyszer-hatóanyagoktól megkövetelt tisztasággal történő előállítását. Ezeket a hátrányokat ki lehet küszöbölni, ha az Arthrobacter simplex-szel végzett A'-dehidrogénezést a fermentációs közeg egy liteijére számítva 0,04 g-0,J2 g kobalt(II)ion jelenlétében valósítjuk meg. Alacsonyabb kobaltion-koncentráció alkalmazása nem ad említésre méltó eredményt, magasabb koncentrációban pedig a kobaltionok inhibitorként viselkednek. Kobalt(I íjionokat szolgáltató alkalmas vegyületként a vízben oldható kobaltsókat, mint például a kobalt(II)-kloridot, a kobalt(Il)-nitrátot, a kobalt(II)-szulfátot vagy a kobalt(II)-szulfát-víz (l/7)-et [régebbi ismert nevén kobaltoszulfát-heptahidrát = CoS04 • 7 H20)] nevezzük meg. Az eljárási megvalósítása szempontjából ezen sók anionjának nincs jelentősége, mivel a kobalt(II)sók a táptalajban disszociálnak. A találmány szerinti eljárást egyébként olyan körülmények között valósítjuk meg, melyek szteroidoknak az Arthrobacter simplex specieshez tartozó mikroorganizmusokkal végzett mikrobiológiai A1 -dehidrogénezésére általában alkalmazni szoktak. A szóban forgó mikroorganizmus számára szokásosan használt tenyésztési körülmények között a tenyésztés egy erre alkalmas tápoldatban, szubmerz kultúrában, levegőztetés közben történik. Ezután adjuk hozzá a tenyészethez a szubsztrátumot, amelyet előzőleg valamilyen alkalmas oldószerben oldunk vagy előnyösen emulgeálunk. A fermentálást ezután addig folytatjuk, amíg a szubsztrátum maximális átalakulását eléijük. A szubsztrátum oldására alkalmas oldószerek közül példaképpen a metanolt, az etanolt, a glikolmonometil-étert, a dimetil-formamidot, a dimetilszulfoxidot és a hexametil-foszforsav-triamidot említjük meg. A szubsztrátum emulgeálását például úgy valósítjuk meg, hogy azt mjkronizált formában, vagy valamilyen vízzel elegyedő oldószerben (például metanolban, etanolban, acetonban, glikolmonometil-éterben, dimeti-formamidban vagy dimetil-szulfoxidban) oldva, erős turbulenciával fú_ vókán keresztül vízbe nyomjuk. A víz (amely előnyösen mésztelenített) valamilyen szokásos emulgeálószert tartalmaz. Alkalmas emulgeálószerek a nem ionogén emulgeátorok, mint például az etilénoxid-adduktok vagy a poliglikolok zsírsavakkal képezett észterei.-Alkalmas emulgeátorként a kereskedelemben kapható ned vési tőszereket, mint például a Tegin(R), Tagat(R), Tween(R) és Span<R) néven forgalomban levő készítményeket nevezzük meg. A szubsztárum koncentrációjának, továbbá a szubsztrátum-beadagolás időpontjának, valamint a fermentáció idejének optimuma az alkalmazott mikroorganizmustól és annak tulajdonságaitól függ. Ezeket a paramétereket esetenként úgynevezett előkísérletekkel kell meghatározni. A szteroidok mikrobiológiai átalakításánál ez egy olyan általános követelmény és fogás, amely a szakemberek előtt jól ismert. Az alábbiakban következő példák a találmány szerinti eljárás közelebbi bemutatására szolgálnak. Ezekben a kiviteli példákban a „protein-hidrolizátum”-ot az Organic Synthesis, Col. Vol. I, 194. oldalán ismertetett előírás szerint, proteintartalmú anyagból (toll-liszt) kiindulva állítottuk elő, de a hidrolízis elvégzése után az anyagot ammóniával semlegesítettük és sterilre szűrtük. A kapott szűrletet ezután minden továvbbi tisztítás nélkül „protein-hidrolizátum”-ként használtuk. Az alkalmazott kukoricalekvár 50%-os szilárdanyag-tartalmú (gyártó: Freres Roquette, Franciaország). A példákban használt élesztőkivonat 80% szilárdanyag-tartalm.ú (gyártó: Ohle cég, Hamburg). Az alkalmazott Silikon SH típusa SH 780, a Pluronic poliéterglikol (gyártó: Wyandotte); mindkét termék habzásgátló hatású. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
