187153. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált glükoamiláz enzim-készítmény előállítására
1 187 153 . 2 tillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,65 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás: 3,9 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. 10. példa 0,5 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 6,2 mekv/g, szemcsenagysága 100-320 pm volt, 50 ml 0,1 mólos nátrium-acetát oldatban (pH 8,5) szuszpendáltunk, majd jeges vízfürdőn, állandó keverés közben hozzáadtunk 1 g N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot. 10 perc további kevertetés után a reakcióelegyhez 1,7 ml glükoamiláz oldatot (117,7 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 8,5-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a szuszpenziót. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt szűréssel elválasztottuk és háromszor 50 ml 0,1 mólos nátrium-acetát oldattal (pH 8,5), háromszor 50 ml - 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó - 0,1 mólos nátrium-acetát oldattal (pH 8,5), majd háromszor 50 ml 0,1 mólos nátriumacetát oldattal (pH 8,5) mostuk. Végül a gélt desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,7 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás: 2,2 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. 11. példa 0,5 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 6,2 mekv/g, szemcsenagysága 100-320 pm volt, 50 ml 0,1 mólos nátrium-acetát oldatban (pH 9,0) szuszpendáltunk, majd jeges vízfürdőn, állandó keverés közben hozzáadtunk 1 g N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot. 10 perc további keverés után a reakcióelegyhez 1,7 ml glükoamiláz oldatot (117,7 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 9,0-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertük a szuszpenziót. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt Szűréssel elválasztottuk és háromszor 50 ml 0,1 mólos nátrium-acetát oldattal (pH 9,0), háromszor 50 ml - 1 mól nátrium-klorid oldatot tartalmazó - 0,1 mólos nátrium-acetát oldattal (pH 9,0), majd háromszor 50 ml 0,1 mólos nátriumacetát oldattal (pH 9,0) mostuk. Végül a gélt desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,8 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás: 1,25 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. 12. példa 2. táblázat A pH hatása a glükoamiláz enzim immobilizálására Akrilex C-100 hordozó alkalmazása esetén A reakcióelegy pH-ja Immobilizált aktivitás (%) Oldott állapotban visszanyert aktivitás (%) Aktivitás veszteség (%) A termék aktivitása (cgység/g xerogél) 4,5 0,4 56,5 43,1 0,85 5,0 0,5 54,8 44,7 0,75 6,0 0,7 52,2 47,1 1,35 7,0 1,3 49,1 49,6 3,00 7,5 4,3 45,3 50,4 5,70 8,0 2,5 41,0 56,5 3,90 8,5 U 44,0 54,9 2,20 9,0 0,7 42,0 57,3 1,25 0,5 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 6,2 mekv/g, szemcsemérete 100-320 pm volt, 50 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferben (pH 7,5) szuszpendáltunk, majd jeges vízfürdőn, állandó keverés közben hozzáadtunk 0,5 g N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)-etiI]karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot. 10 perc további keverés után a reakcióelegyhez 2 ml glükoamiláz oldatot (125 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 7,5-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a szuszpenziót. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt szűréssel elválasztottuk és háromszor 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5), háromszor 50 ml - 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5), majd háromszor 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5) mostuk. Végül a gélt desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,65 g immobilizált glükoamiláz. Aktivitás: 1,32 g glükóz felszabadítása/óra/g xerogél. 13. példa 0,5 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 6,2 mekv/g, szemcsenagysága 100-320 pm volt, 50 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferben (pH 7,5) szuszpendáltuk, majd jeges vízfürdőn állandó keverés közben hozzáadtunk 0,5 g N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)-etil]karbodiimid-metil-p-toluoi-szulfonátot. 10 perc további keverés után a reakcióelegyhez 1 ml glükoamiláz oldatot (125 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 7,5-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a szuszpenziót. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt szűréssel elválasztottuk és háromszor 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5), háromszor 50 ml - 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó - 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH 7,5), majd háromszor 50 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
