187039. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rákos megbetegedések kezelésére alkalmas növényi extraktumok előállítására
1 2 Íuk és fagyasztva szárítjuk. Dymódon 630 g vízoldlató sötétbarna, por alakú terméket (i) nyerünk, amely 45% (1) képletű vegyületet tartalmaz. A visszamarad 8,05 kg nedves pépet 201 fonásban lévő abszolút etanollal extraháljuk. A szűrletet az előzőekben ismertetett módon kezelve fagyasztva szárítjuk. 99 g, vízben szinte teljesen oldódó, sötétbarna, por alakú terméket (ii) nyerünk, amely 42% (1) képletű vegyületet tartalmaz. f) 10 kg vékonyan szeletelt H. obtusa-obtusa gumót fagyasztva szárítunk, 3,086 kg száraz anyagot nyerünk. Ezt a száraz anyagot megőröljük, és 300 g-nyi mennyiségét 5 1 forrásban lévő 50%-os etanollal 5 percig extraháljuk. Az extraktum szűrletét az előzőekben leírt módon kezeljük és fagyasztva szárítjuk. llymódon 116 g vízoldható, halvány krémszínű, por alakú terméket nyerünk, amely 35% (I) képletű vegyületet tartalmaz. g) Fiatal H. obtusa-nitida pépesített gumóját 5 1 forrásban lévő vízzel 5 percig extraháljuk. Az extraktum szűrletét fagyasztva szárítjuk, ilymódon 54 g, vízben részlegesen oldódó, halványbama, por alakú terméket nyerünk, amely 32% (I) képletű vegyületet tartalmaz. h) Fiatal H. obtusa-nitida gumók g) pont szerinti extraktumának forralási idejét 20 percre növeljük. 82,3 g, viszonylag oldhatatlan, barna, por alakú terméket nyerünk, amely 27% (1) képletű vegyületet tartalmaz. i) 1,5 kg friss Hypoxis acuminata gumót szobahőmérsékleten 2 1 etanolban pépesítünk. A pépet 1 órán át keverjük, majd leszűrjük. A szűrletet vákuumban 30 KPa nyomáson, 70—85 °C hőmérsékleten bepároljuk. A visszamaradó anyagot fagyasztva szárítjuk. Sárgásbarna színű, a friss gumó 7-10%-át kitevő mennyiségű terméket nyerünk, amelyben az (1) képletű vegyidet mennyisége 42-57% között változik. A hozam nagyságának változása szezonális eltérésekből adódik. j) Friss Hypoxis acuminata gumókat közvetlenül folyékony nitrogénbe szeletelünk. A megfagyott szeleteket fagyasztva szárítjuk, majd finom porrá őröljük. A kapott port 1 ü arányú víz, alkohol-etanol vagy metanol-eleggyel extraháljuk 1 kg növényi porhoz 6 1 extrahálószert alkalmazva. 30 perces keverés után az elegyet leszűrjük. A szűrletet a 2i. példában leírt módon bepároljuk. A kiindulási anyagul szolgáló friss gumó mennyiségének 9-12%-át kitevő sárgásbarna terméket kapunk, amely 49-56% (I) képletű vegyületet tartalmaz. A hozam szezonális eltérésektől függő. k) Pépesített Spiloxene schlechteri gumók vizes-etanollal való kezelésével jelentős mennyiségű (1) képletű vegyületet tartalmazó extraktumot kapunk. Az ismertetett vizsgálati eredményeket összehasonlító vékonyrétegkromatográfiás és nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárásokkal nyertük. Látható, hogy az előbbi példában, oldószerként metanolt vagy vizes etanolt alkalmazva, és az extrahálást alacsony hőmérsékleten rövid ideig végezve kiemelkedően jó hozamokat kapunk. Ez az eredmény ellentétben áll az eddig ismert eredményekkel. Az 1.417.272. számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentés 3(a), 3(b) és 3(c) példájában például látható, hogy nem tudtak vagy csak igen kis mennyiségben tudtak szterint kiextrahálni, ezért ezt az extrakciós eljárást elvetették: Valójában nem ismerték fel, hogy ezzel az extrakciós eljárással egy a kívánttól eltérő vegyületet, a jelen találmány szerinti vegyületet extraháltak ki nagy hozammal. 3. példa A találmány szerinti extraktumok aktivitásának igazolására in vitro citotoxicitási vizsgálatokat végeztünk M/52/B sejttenyészetben. M/52/B egér szarkóma sejteket tenyésztettünk egyrétegűén M.E.M.-ben 106 boíjúeinbrió szérummal. A tenyészet összenövése után, ami a palackonként alkalmazott sejtszámtól függően rendszerint 3—4 nap alatt következett be, a sejteket tripszinnel kezeltük. A sejtszuszpenziót, miután felszabadult, 10% botjúembrió szérumot tartalmazó M.E.M.-mel kezeltük a tripszin inaktiválására. Ezután a szuszpenzióból tetszőleges mennyiséget friss táptalajra vittünk, hogy együttes végtérfogatuk 5 ml legyen. A vizsgálandó anyagot különböző koncentrációkban a frissen készített sejtszuszpenzióhoz vagy a 24 órás, legalább 40-50%-osan fedett egyrétegű sejtteszészethez adtuk. Minden műveletet steril körülmények között lamináris áramlású kamrában (laminer flow chamber) végeztünk. Eredményeinket az alábbiakban összegezzük. Megfelelő mennyiségű vizsgálati anyag adagolása esetén a sejtek 24 órán belül elpusztulnak. Másszóval az átvitt sejtek nem tapadnak a szövettenyésztő-lombik aljfelületén, míg a kontrollsejtek 48-72 órán belül összefüggő egyrétegű tenyészetet képeznek. Ha a szükségesnél kevesebb vizsgálati anyagot használunk, az első 24 órában a sejtek bizonyos mértékű regenerálódása észlelhető a tenyésztőedényekben. Ezekben az esetekben azonban a 40-60%-os fedettséget 10 napnál hosszabb idő alatt érjük el, jelezve ezzel, hogy az átvitt sejtek nagyobb része teljesen elpusztult. 189.039 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
