186970. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emberi kötőszövetsejthez adaptált hepatitisz A-vírus előállítására
4 186970 5 MENZ vagy MPZ sűrű növésű monolayer rétegeit HAV-tartalmú szuszpenzióval inkubálunk, aminek folytán a vírusok a sejtekre adszorbeálódnak. Ezután alkalmas tápközeget adunk a sejtekre és a sejteket 34—37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Tápközegként 5 pl. alkalmazhatunk Hanks sóval vagy Earle sóval készített ún. „minimal essential medium” tápközeget, de más tápközeg is alkalmazható. Az inkubációs idő általában néhány nap és egy-két hét közötti. Az inkubációs idő eltelte után alkalmas teszt módszerrel ki- 10 mutatjuk a sejtekből a tápközegbe került HAV menynyiségét, amely a fentiek szerinti tenyésztésnél 106—108 TÓID (tissue culture infectious dosis) közötti. A felszabadított HAV alkalmazható közvetlenül tesztekhez, amelyekben antitestek jelenlétét kívánjuk kimu- 15 tatni emberi vagy állati szérumokban, megfelelő tisztító és inaktiváló lépések után pedig vakcinaként alkalmazható akár a humán gyógyászatban, akár állatok kezelésénél. 3. 'példa Diagnosztikai alkalmazás A találmány szerint sejtkultúrákban előállított víru- 25 Bök diagnosztikai tesztekben ugyanúgy alkalmazhatók, mint az emberi székletből elkülönített vírusok. Rádióimmunassay és enzimimmunassay tesztekben a sejtzárványból elkülönített HAV/MENZ/MFZ közvetlenül . is alkalmazható antigénként. így pl. a HAV/MENZ/ 30 /MPZ közvetlenül kapcsolható szilárd fázissal, amelyhez azután a vizsgált személytől nyert antitest (továbbiakban: paciens antitest) köthető. A HAV/MENZ/ /MFZ anti-HAV testen át is kötődhet szilárd fázishoz, ezt követő páciens antitest kötődéssel; antigén oldat- 35 ként is kapcsolható szilárd fázishoz kötődő páciens antitesttel. Általánosságban mondható, hogy a sejtkultúrából nyert HAV/MENZ/MFZ anti-HAV testek kimutatására szolgáló bármely tesztben alkalmazható antigénként. 40 4. példa Terápiái alkalmazás 45 A HAV/MENZ/MFZ kellően legyengített virulenciájú élő-vakcinaként alkalmazható, mint oltóanyag. Már néhány passzázs után kielégítő mértékű a virulencia gyengülése. Holt-vakcinaként is alkalmazható a találmány szerint adaptált vírus tisztítás és inaktiválás után, ami önmagában ismert módon végezhető. Ha élő-vakcinaként kívánjuk a vírust az oltóanyagban alkalmazni, olyan passzázsból különítjük el, amelyben a vírus virulenciája eléggé legyengült ahhoz, hogy az emberben már ne váltson ki betegségi szimptomát, de az oltott alanyban még eléggé szaporodik ahhoz, hogy antitesteket indukáljon. Ez az állapot az ötödik és huszadik passzázs között érhető el. Ha az oltóanyagban holt-vakcinaként kívánjuk alkalmazni, a vírusantigént előbb koncentráljuk, majd tisztító műveletekkel eltávolítjuk a zavaró kísérő proteineket. A tisztítás ismert alkalmas módszere pl. a szacharóz- vagy cézium-kloridoldatos gradiens centrifugálás, továbbá az oszlopkromatográfia vagy az affinitás-kromatográfia. Az inaktiválás vagy ekkor vagy már előbb végezhető, pl. formaldehid vagy propiolakton alkalmazásával. A tisztított HAV-antigén kapcsolható adjuvánssal, pl. alumínium-hidroxid hordozóval, de hordozó nélkül is alkalmazható holt-vakcinaként; a beadás módja általában intramuszkuláris vagy szubkután injekció. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás emberi kötőszövetsejthez (továbbiakban: MFZ) adaptált hepatitisz A-vírus (továbbiakban: HAV) előállítására és kívánt esetben az így kapott hatóanyag további kikészítésére, azzal jellemezve, hogy székletből elkülönített HAV-t emberi magzati vesesejteken (továbbiakban: MENZ) tényésztünk és a szabaddá vált vírusokkal [továbbiakban: HAV/ /MENZ] MFZ-t fertőzünk és kívánt esetben az így kapott hatóanyagot [HAV/MENZ/MFZ] a diagnosztikában, illetve terápiában szokásos módon — tisztító és inaktiváló műveletek, hordozó, kötőanyagok szükség szerinti alkalmazásával — preparátummá kikészítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 11 em e z v e, hogy a HAV növekedési sebességét a MENZ- n úgy növeljük, hogy az első passzázs során kb. a beoltás utáni 7—8. hétben a tápközegben, illetve a sejteken megjelenő primer HAV-t kinyerjük és újra MENZ-be oltjuk (passzáljuk) és ezt a folyamatot többször megismételjük és az így passzázsonként mintegy 1—2 héttel csökkenő növekedési időtartammal kapott, MENZ-hez adaptált HAV-t hasonló módon, t öbbszöri passzálással adaptáljuk MFZ-hez. Kiadásért felei: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 87.2595 — Kossuth Nyomda, Budapest. Felelős vezető: Bede István vezérigazgató 3
