186868. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás 9-hidroxi-3-oxo -4,17(20)-pregnadién- 2O-al előállítására
A találmány tárgya fermentációs eljárás szteroidok, közelebbről a 9-hidroxi-3-oxo-4,17(20)pregnadién-20-karboxaldehid előállítására. [(I képletü vegyidet)] A 4029 549. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Mycobacterium fortuitum NRRL B—8119 alkalmazását ismertetik 9-hidroxi-3-oxo-4-pregnén-20-karbonsav(9-hidroxi-bisznorsav) előállítására. Azonos mikroorganizmus alkalmazását írják le a 4035 236. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban 9-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion(9-hidroxi-androszténdion) előállítására és a 4214051. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban 9-hidroxi-3-oxo-4-pregnén-20-karbonsav-metilészter(9- hidroxi-bisz-norsav-metilészter) előállítására. A 79 104 372.2 számú európai szabadalmi bejelentésben kétlépcsős fermentációt ismertetnek a 9- hidroxi-3-oxo-4,17(20)-pregnadién-20-karbonsav előállítására, mely vegyület értékes kortikoidok előállítása során köztitermékként alkalmazható. Az eljárás során első lépésként a szterineket fermentációs úton, Mycobacterium NRRL B-8054 törzs alkalmazásával 3-oxo-4,17(20)-pregnadién- 20-karbonsavvá alakítják, majd ezt a vegyületet a hidroxilcsoport 9-a helyzetbe vitelére képes mikroorganizmusok bármelyikével 9-hidroxi-vegyületté alakítják. Kidolgoztunk egy olyan fermentációs eljárást, mely az új, hasznos köztitermék, a 9-hidroxi-3-oxo- 4,17(20)-pregnadién-20-karboxa!dehid előállítására szolgál. Az eljárás végrehajtásához az M. fortuiium NRRL B-8119 egy mutánsát használhatjuk. Az eljárás során használjuk a 4029549. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett kettős mutánsokat, amelyek a Mycobacterium nemzetségből származnak. E nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok szterin-bontó képessége jól ismert. Ebbe a nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok vad törzsei a színeket nem szelektíven kis molekulasúlyú vegyületekre, például széndioxidra és vizre bontják. Az előzőekben leírt vad törzsekből a 4029 549. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1. példájában közölt eljárás szerint mutánsok nyerhetők. Példánkban M. fortuitum NRRL B-8119 előállítását ismertetjük. Az előzőekben ismertetett nemzetségekből, a 4029 549. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1. példájában közölt eljárással nyert mutánsokból az itt ismertetésre kerülő mutációs eljárással újabb mutánsok nyerhetők. Ezek az utóbbi mutánsok, mint azt a M. fortuitum NRRL B-12433 példáján bemutatjuk, a következőkben ismertetésre kerülő fermentációs eljárásban (1) képletű vegyület előállítására alkalmasak. A Mycobacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok mutációjával olyan mutánsok nyerhetők, amelyekre a szterinek szelektív bontására való képesség és a fennentlében főtermékként 9- hidroxi-3-oxo-4,17(20)-pregnadién-20-karboxaldehid felhalmozása jellemző. Szterineken 19 szénatomos szteroid vázzal rendelkező, a 3-as helyzetben P-konfigurációjú hidroxilcsoportot, az 5- és 6-szériatom között kettős kötést és a 17-helyzetben 2-10 szénatomos oldalláncot tartalmazó vegyületet értünk. . ; A következőkben példát ismertetünk* a talál-* mány szerinti eljárásban használt mutáns előállítás sára. A példában M. fortuitum NRRL B-12433? mutánst nyerünk. Hasonló mutánsok nyerhetők a.; következő referenciapéldákban szereplő eljárás sze-í, rint más Mycobacterium fajokból is. Referenciapélda A szíerin lebontás fatermékeként 9-hidroxi-3-oxo-4,17(20) -pregnadién-20-karboxaldehidet termelő mutáns előállítása-Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119-et te-, nyésztünk 31 *C-on, literenként 8 g peptonos húslevest (3 g/1 marhahúskivonat és 5 g/1 pepton; Difco Company, Detroit, Michigan, USA), 1 g élesztôkivonatot, 5 g glicerint, 0,1 vegyes% Tween 80-at és desztillált vizet tartalmazó táptalajban. Ezt a táptalajt 20 percen át, 1,03 • 105 Pa nyomás alatt autoklávban sterilezzük. A sejteket 5 • 108 ml sűrűség eléréséig szaporítjuk, majd 0,2 mikronos steril szűrőn összegyűjtjük. A sejteket azonos térfogatú steril, 0,1% Tween 80-at tartalmazó, pH 5,6-os 0,1 mól/1 nátrium-citráttal mossuk, s ugyanebből a pufferből fél térfogatnyi mennyiségben felszuszpendáljuk. Annyi N-metil-N’-nitro-N-nitrózó-guanidint adunk hozzá, hogy koncentrációja 100 pg/ml legyen, és a sejtszuszpenziót 31 *C-on 1 óra hosszat inkubáljuk. Ezután a sejteket 2 térfogat steril, 0,1% Tween 80-at tartalmazó pH 7, 0,1 mól/1 káliumfoszfát pufferrel mossuk, és 1 térfogat azonos pufferben felszuszpendáljuk. Literenként 8 g peptonos húslevest, 5 g nátrium-kloridot, 5 g glicerint és desztillált vizet tartalmazó táptalajt készítünk. 15 g/1 agart adunk hozzá és a táptalajt 20 percig 1,03 • 105 Pa nyomás alatt autoklávban sterilezzük, majd steril petri csészékbe öntjük. Ezután a mutagénnel kezelt sejteket ezen a táptalajon szélesztjük, majd a lemezeken kinőtt telepeket kis léptékű fermentációban vizsgáljuk meg, hogy mérjük szterineket (I) képletü vegyületté alakitó képességüket. A kívánt vegyületet a kísérleti fermentáció során nyert fermentlé metilén-kloridos extraktumából mutatjuk ki vékonyréteg kromatográfiával. Ehhez szilikagél réteget és metilén-klorid, aceton és ecetsav 212 : 38 : 1 arányú elegyet mint futtatószert alkalmazunk. Ily módon izoláljuk az NRRL B-12 433 mutánst, mely a szterinek biológiai átalakításának, fő termékeként 9-hidroxi-3-oxo-4,17(20)-pregnadién-20-karboxaldehidet halmoz fel. Az itt leírthoz hasonló mutáns előállításának feltétele, hogy az NRRL B-8119-hez hasonlóan a szteroid gyűrű lebontásában gátolt, ennek következtében 9-a-hidroxi-androszténdiont termelő törzsből kell kiindulni, s ebben kell létrehozni egy második mutációt, mely a szterin oldallánc lebontására van hatással. A biológiai átalakítással létrehozott mutáns csak a szteroid molekulára kifejtett hatásában tér el az anyakultúrától, azaz a Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119-től. Minden más szempontból, mint például morfológiailag, gyógyszerérzékenység 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
