186864. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tiszta hepatitis B felületi antigén előállítására humán plazmából
1 .180 »04. 2 előtt a fenti térfogatra hígítjuk ionmentes, apirogén vízzel készült foszfátpufferrel. Ilyen vizet az ELGA Co. (Nagy-Britannia) által gyártott készülékkel lehet előállítani. A szűrés folyamán az előzőleg pepszinnei emésztett plazma-fehérjéket teljes mértékben kimossuk. A szűrés után nyert, a tisztított HBsAg-t tartalmazó oldatot 10000 ml-es részletekbe osztva 96 óra hosszat hűtőbe helyezzük, és az 1: 2000 térfogatarány biztosításához szükséges mennyiségű formaldehidet adunk hozzá. Az oldatot azután kivesszük a hűtőből és a formaldehidet dialízissel eltávolítjuk belőle. Az oldathoz azután milliliterenként 1 mg alumínium-hidroxidot adva a HBsAg-t adszorbeáltatjuk. Az így nyert vakcinát azután ampullákba töltjük. A fenti módon kapott vakcina humán plazmafehérjék jelenlétére agarban kétszeres diffúzióval vizsgálva nem mutat precipitációs vonalat 30-szorosan sűrített anti-humán-plazma-fehérjéknél. A kapott vakcina fertőző hepatitis B vírus részecskéket sem tartalmaz. Példa Egy donortól plazmoforézissel HBsAg plazmát veszünk. A HBsAg aktivitásának titere immunoelektroforézissel meghatározva nem alacsonyabb mint 1:16. A humán plazmát lipidmentesitjük oly módon, hogy 1 liter plazmához 1 liter 0,1 mólos MnCl2 ■ 4H20 oldatot és 150000 nemzetközi egység (30 ml) heparint adunk. Az elegyet 0,5 óra hosszat elektromágnesen keverőben szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután az oldatot Beckman J-6 típusú, JA-10 rotorral felszerelt centrifugában 6000 ford/perc sebességgel 30 percig centrifugáljuk. Az üledéket, miután nem tartalmaz HBsAg-t, eldobjuk és a felülúszót 2 literes lombikba öntjük. A kapott folyadékhoz 7,5 %-os PEG 6000 oldatot adunk, az oldat pH-ját 1 n sósavval 5,5-re állítjuk be, és az egészet egy hűtőbe helyezzük, ahol egy éjszakán át keverjük. A következő napon lecentrifugáljuk a fent említett centrifugával, 6000 ford/perc sebességgel. A fe-. lülúszói, miután nem tartalmaz HBsAG-t, eldobjuk. Az üledéket 200 ml 10,9 %-os nátrium-kloridban oldjuk és térfogatát ionmentes vízzel 2 1-re egészítjük ki. 20-30 perc múlva csapadék jelenik meg, amelyet a fenti módon centrifugálva eltávolítunk. A kapott tiszta szűrlet HBsAg titere immuno-elektroforézissel meghatározva 1 :8. Az oldat térfogatát ionmentes vízzel 10 1-re egészítjük ki (2 1 + 8 1 ionmentes víz). 30 perces állás után kis mennyiségű csapadék keletkezik, amelyet a fenti módon centrifugálva eltávolítunk. A tiszta felülúszó titere immuno-elektroforézissel meghatározva 1:2. 101 oldathoz 90 g nátrium-kloridot adunk, és igy nátrium-kloridra nézve 0,9 %-os oldatot kapunk. Az így kapott oldatot 12 óra hosszat 37 *C-on inkubáljuk. Ezután a 37 *C-os és 2,5 pH-jú oldathoz 0,05 mg/ml pepszint adunk, azaz a 10 1 oldathoz 0,5 g peps.ánt. A pepszines emésztést 37 *C-on 1 óra hossza végezzük. Az 1 óra elteltével az emésztést úgy ülítjuk le, hogy 0,1 n nátrium-hidroxiddal 3,5-re á lltjuk a pH-t. A keletkeze .1; csapadékot a fenti típusú centrifugával 20 percig 6000 ford/perc sebességgel lecentrifugáljuk és eldobjuk. * A felülúszót az AMICON Co. által gyártott DC 30 típusa H 10 x 100 szűrőbetétet tartalmazó molekulaszűrőn szűrjük le.. A molekulaszűréssel kapott anyag térfogata 10 1, titere immuno-elektroforézissel mérve 1 : 2. A kapott anyag 100-szoros sűrítésnél immundiffúziós technikával agaron állati plazmával - anti- IgG, anti-IgM, anti-IgA, anti humán fehérje, anti humán plazma-fehérje - szemben nem mutat precipitációs vonalat. Laboratóriumi állatok, mint pl. tengerimalac vagy nyúl, 100-szoros süritésű anyaggal végzett vakcinálása nem vált ki immunreakciót a humán plazmából származó preparátummal szembem Az ismertetett eljárással előállított anyag eresen immunogén a csimpánzokon és embereken végzett vakcinálás tanúsága szerint. A hepatitis B vírus elleni vakcina kémiai jellemzői HBsAg 0,5 mikrogramm/cm3 Teljes fehérjetartalom 0,5 mikrogramm/cm3 30 000 mólsúlyú polipep- 0,02 mikrogramm/cm3 tidek Nátrium-klorid 0,85 % Alumínium-hidroxid 1 mg/cm3 Mertiolát 100 mikrogramm/cm3 Az anyagban nagy érzékenységű radioimmunológiai és enzimimmunológiai tesztekkel HBcAg, HBeAg és DNS-polimeráz nem mutatható ki. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás tiszta hepatitis B antigén előállítására humán szérumból oly módon, hogy a lipideket és a humán szérumfehérjék egy részét eltávolítjuk, a ballaszt proteineket pepszinnei emésztjük, és az immunológiaiíag aktív antigén részecskéket formaldehiddel végzett inaktiválás közben izoláljuk, azzal jellemezve, hogy a lipidmentesített és részben fehérjementesített kiindulási anyagot 0,01-0,5 mg pepszin/mg fehérje mennyiségű pepszinnei emésztjük, majd foszfátokkal 7,1—7,3 közötti pH-ra pufféról va, a szennyezéseket 100000 Dal tonnái kisebb részecskéket átengedő szűrőn kiszűrjük, és az antigént formaldehiddel inaktiváljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve. hogy az emésztéshez 0,05 mg/mg fehérje menynyiségű pepszint használunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy a plazma-fehérjéktől megtisztított antigént 96 óra hosszat 1 : 2000 térfogatarányban vett formaldehiddel inaktiváljuk. 5 10 15 20 25 30 '35 40 45 50 55 60 Ábra nélkül
