186825. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs-alkaloidok, főként ergokornin, alfa-ergokriptin és béta ergokriptin parazita úton való előállítására
1 186J825 2 A találmány tárgya eljárás anyarozs alkaloidok, főként ergokomin, alfa-ergokriptin és béta-ergokriptin 32:1 arányú keverékének parazita úton való előállítására, Claviceps purpurea törzs új variánsával. A korábbiakban az ergokomin és ergokriptin előállítását kizárólag szaprofita módon külön-külön végezték, s a felhasználás során készítették a megfelelő arányú keveréket. Parazita körülmények között, főleg ergokomint, alfa-ergokriptint és béta-ergokriptint 32:1 arányban, lényegében ergozinmentesen termelő törzs nem létezett. Ismeretes volt olyan vegyes alkaloidtartalmú parazita anyarozs törzs (Országos Közegészségügyi Intézetnél 00234 szám alatt deponálva), mely az összalkaloid mennyiségének csak mintegy 50%-ában tartalmazott ergokomin és ergokriptin alkaloidokat, és 50%-ban szennyező ergozint. A találmány célkitűzése olyan eljárás kidolgozása az ergokomin, alfa-ergokriptin és béta-ergokriptin parazita úton való előállítására, amelyben a parazita Claviceps purpurea törzs új variánsa- mesterséges táptalajon,agar felületen és süllyesztett tenyészetben jól spórázik,- spórái jól tartósíthatok,- spórái életképesek és virulensek,- magas droghozamot biztosít,- a drog 50%-ban ergokomint, 33%-ban alfa-ergokripUnt.és 17%-ban béta-ergokriptint tartalmaz. Az új törzs előállítását a mutációt előidéző sugárkezelés, valamint az ivaros és szelekciós nemesítési mód alkalmazásával végeztük. Az OKI 00234 szám alatt deponált vegyes alkaloid tartalmú törzs droganyagából küllemileg megfelelő, simafelületű, nagyméretű szlderóciumokat választottunk ki. Ezeket a szlderóciumokat 1200-1500 Gy dózisú rádioaktív gamma-sugárzásnak vetettük alá, amely sugárdózist 12-15 óra alatt folyamatosan juttattuk a szkleródumokhoz. A kezelt szkleróciumokból steril darabkákat oltottunk 10%-os malátaagar táptalajra. A letális dózis körüli sugármennyiséget túlélt szkleróciumokból létesített tenyészeteket az 1. példában leírt táptalajra oltva, 6 napos tenyésztés után újabb 500-800 Gy dózissal ^ugárkezeltük. A kezelt spóratömeget maláta-agar felületre szélesztettük. Kiválasztottuk és izoláltuk az eltérő morfológiájú telepeket, felszaporítás után spóráikat izoláltan rozskalászra oltottuk. Minden kifejlődött szklerócium felét vékonyrétegkromatográfíás módszerrel analizáltuk. A több száz szklerócium vizsgálata során találtunk néhány mutáns egyedet, amely főleg ergokomin alkaloidot tartalmazott lényegében ergozinmentesen. Azokat a szlderóciumokat{ amelyeknél az ergokomin mellett alfa- és béta-ergokriptin jelenléte volt jellemző az alkaloidszint javítása, valamint a megfelelő 32:1 arány kialakítása céljából ivaros nemesítési folyamatnak vetettük alá. A szlderóciumokat nedves homokba ágyaztuk és 6 hétig 0-5 °C-on tartottuk, majd a felületet steril vízzel lemosva Petri-csészében nedvesen tartott steril szivacsra helyeztük. A sztrómák kialakulása és kifejlődése után kiválasztottuk a legfejlettebbeket, amelyek felületén a peritédumok kitüremkedései mikroszkópi vizsgálat alapján a legnagyobbak voltak. Ezeket 10%-os maláta-agar táptalaj fölött, steril körülmények között, hőráhatással aszkospórák kilövetésére késztettük. A kilövelt aszkospórákból kialakulj telepeket a telep fejlődési üteme, spóratermelő képessége, morfológiája alapján szelektáltuk és izoláltuk. Az izolált telepek spóráit szubmersz tenyészetben felszaporítottuk és izolált parazita körülmények közé helyeztük, rozsnövények oltótűs fertőzésével. Az izoláaót 20 m"1 -es rozssáv biztosította. A kifejlődött szkleródumokat vékonyrétegkromatográfiás analitikai vizsgálatok alapján szelektáltuk, az alkaloid spektrum és az alkaloidszint alapján. A legnagyobb mennyiségben, ergozinmentesen, 50%-ban ergokomint, 33%-ban alfa•ergokriptint és 17%-ban béta-ergokriptint tartalmazó szkíeródum metszeteket oltottunk maláta-agar táptalajra és felületi tenyészeteket készítettünk. Ezekből a felületi tenyészetekből a konidiumokat a példában leírt folyékony táptalajban oltva felszaporítottuk. A legtöbb konidiumot termelő tenyészeteket választottuk ki az életképesség figyelembevételével'.' A kiválasztott tenyészetek spóráit izolált parazita körülmények közé helyeztük, rozsnövények oltótűs fertőzésével , ahol a droghozam és a drog minőségi jellemzői szerint szelektáltuk. A szelekdós nemesítési munkát további 2 éven át folytattuk. Az új törzset, amelynek intézeti jelzése Bk7 /1 / /1981, az Országos Közegészségügyi Intézetben 00235 szám alatt deponáltuk. Az új törzs a kiindulási tenyészethez képest a spórafermentádóban és a drogtermesztésben az alábbi eredményeket adta : 5 10 15 20 25 30 35 40 2
