186734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek enzimatikus előállítására
1 ! 86 73 1 2 a reakcióidő 2-5 óra. Míg a Bz-Aia-Val-OH kitermelések a magasabb amin-komponens koncentrációval nőttek (Id ábra), addig a kitermelés és Bz-Ala-OMe szubsztrátkomponens koncentrációja közötti összefüggés fordított (le ábra). Ez utóbbi megfigyelés szerint, valamint a ki- 5 termelés enzimkoncentrációtól való függősége miatt (le ábra) kívánatos egy optimális szubsztrát-enzim koncentrációarány. A korábban ismertetett reakcióegyenlet alapján végzett reakció időfüggésének optimumát a 2. ábra szemlél- 10 teti. 0,5 mólos valin jelenlétében a Bz-Ala-OMe szubsztrátot viszonylag gyorsan (20 percen belül) 38 %ban Bz-Ala-Val-OH-vá és 62 %-ban Bz-Ala-OH-vá alakítottuk. Az ábrából az is kiderül, hogy a dipeptid pH 9,7-néI vaiinfelesleg jelenlétében nem hidrolizált. 15 Azonban ha a oH-értéket 5 és 8 közé állítottuk, akkor az összes Bz-Ala-Val-OH-t másodperceken belül sikerült hidrolizálnunk, A CPD-Y ezen szelektív viselkedése magas pH-nál nagy jelentőségű a peptidszintézisben. Lizinre 3 mólos, KCl-re 0,1 mólos és EDTA-ra 1 mmólos (pH = 9.8) oldat 2 ml-ét 100 %-os metanol 400 p\vel és 1 mólos Z-Phe-OMe (100 %-os metanolban oldva) 100 /ul-\cl (0.01 mmól) kevertük. A reakciót az I. példában leírt módszer alapján végeztük cs 0,7 mg karboxípcptidáz-Y hozzáadásával indítottuk. 30 perc reakcióidő letelte után a pH-t 6 mólos sósavval 1-re állítottuk. A reakcióterméket tisztítottuk és nagynyomású kromatográfiával elkülönítettük. A Z-Phe-Lys-OH kitermelése 60 % volt. Az 1. példában leírtak szerint végzett kvantitatív aminosav-analízis eredménye azt mutatta, hogy a (érmék ! ,0 mól lizint és 1,0 mól fcnilalanint tartalmazott. A7 I. cs 2. példákban leírtakhoz hasonlóan készítettük az I. táblázatban szereplő peptídekef a korábban említett kiindulási anyagokból. Valamennyi kísérletet Radiometer pH-stat készülékben végeztük és a kitermeléseket az előzőekben említett HPLC-módszerre! határoztuk meg. Kísérleti paraméterek: 4.5 mmólos CPD-Y, pH 9,7 cs 35 X. 2. példa I. táblázat Karboxipeptidáz-Y-nal katalizált peptidszintézis szabad aminosavakkal, mint amin-komponcnsekkcl Szubsztrát (konc.) Amin-komponens (konc.) Termék Kitermelés %-ban Bz-Ala-OMc Glicin (3,0 mól) Bz-AIa-Gly-OH 62 (55 mmól) Alanin (1,9 mól) Bz-Ala-Ala-OH 65 Valin (0,6 mól) Bz-Ala-Val-OH (1. példa) 40 Leucin (0,17 mól) Bz-Ala-Leu-OH 24 Fcnilalanin (0.16 mól) Bz-AIa-Phe-OH 27 Szerin (3.2 mól) Bz-Ala-Ser-OH 50 Treonin (0,7 mól) Bz-Ala-Thr-OH 24 Metionin (0,6 mól) Bz-Ala-Met-OH 46 Lizin (1,5 mól) Bz-Ala-Lys-OH 56 Arginin (0.8 mól) Bz-A!a-Arg-OH 26 Asparaginsav (1,0 mól) Bz-Ala-Asp-OH 0 Asparagin (0.6 mól) Bz-Ala-Asn-OH 5 Glutaminsav (1,2 mól) Bz-Ala-Glu-OH 0 Glutaminsav-V-metil-észter ( 1,0 mól) Bz-AIa-Glu(OMe)-OH 30 Z-Phc-OMc Valin (0,6 mól) Z-Phe-Val-OH 6 (55 mmól) Lizin (3,0 mól) Z-Phe-Lys-OH (2. példa) 60 Bz-Phe-Gly-OMe (30 mmól) Valin (0,6 mól) Bz-Phe-Gly-Val-OH 40 Z-Ala-OMe Glicin (2,0 mól) Z-Ala-Gly-OH 30 (10 mmól) Alanin (0.7 mól) Z-AIa-AIa-OH 60 Leltein (0.15 mól) Z-Ala-L.eu-OH 21 Lizin (1,5 mól) Z-Ala-Lys-OH 60 Bz-Gly-OMe Glicin (2,0 mól) Bz-Gly-Gly-OH 63 (20 mmól) Lcucin (0.15 mól) Bz-Gly-Lcu-OH 21 Bz-Tyr-OEt Valin (0,6 mól) Bz-Tvr-Val-OH 30 (25 mmól) Alanin (1,9 mól) Bz-Tyr-AIa-OH 46 Arginin (0,8 mól) Bz-Tvr-Arg-OH 35 8
