186734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek enzimatikus előállítására
1 186 73-1 2 nem megfelelő szubsztrátjai a kaiboxipeptidázoknak, a szubsztrát-komponensként előnyösen alkalmazott aminosavészterre vagy peptid-észterre vonatkozó eszterázaktivitás tehát jelentősen meghaladja ezt, így még a pH 5 körüli vagy alatti szintézis lefolyása is lehetővé váiik, Általában elmondható, hogy a pH-optinuim a kiindulási anyagoktól, a képződött peptidcktől cs az alkalmazott enzimtől függ. Ha enzimként CPD-Y-t alkalmazunk, a pH-értéke előnyösen 8,0 és 10,5 között, még előnyösebben 9,0 és 10,5 között van, mint ezt később részletezzük. Ezt a pH-értéket a kapcsolási reakció folyamán tartani kell és ezt követően szabad állítani a reakciótermék kicsapásához, a védőcsoport lehasításához stb. Ennek biztosítása céljából alkalmazható a reakcióközeg kiválasztott pH-tartományának megfelelő puffer, mint a bikarbonatpuffer. Mindemellett, a választott puffer nem lényeges a reakció szempontjából, csak ha az sajátos pH-tartományt igényel. A megfelelő pH-érték fenntartható megfelelő sav, mint sósav vagy bázis, mint nátrium-hidroxid reakció során történő hozzáadásával. A reakciót, mint már említettük, vizes közegben vagy kívánt esetben maximum 50 % szerves oldószert tartalmazó közegben végezzük. Szerves oldószerként előnyösen alkanolokat, például metanolt, etanolt; glikoiokat, így etiléngükolt vagy políetiléngfikolokat, dimctilformarnidot, dimetil-szulfoxidot, tetrahidrofuránt, dioxánt és dimetoxi-etánt alkalmazhatunk. A reakcióközeg összetételének megválasztása elsősorban az oldékonyságtól, hőmérséklettől, a reakciókomponensek és a peptid-termék pH-jától, valamint az enzim stabilitásától függ. A reakcióközeg olyan komponenst is tartalmazhat, amely biztosítja az enzim oldékonyságát, de az enzimaktivitás jelentős részét megőrzi (ioncserélő-gyanták). Másképpen, az enzim immobilizált formában is használható (lásd Methods of Enzymology, Vol. 44. 1976), amikor mátrixhoz, így dextránhoz. sgarózhoz, kovaföldhöz, poliamidhoz vagy cellulózhoz kapcsolják, vagy poliakrilamidba, alginátba vagy szálakba kapszulázzák. Mindemellett, az enzim kémiai úton befolyásolható, hogy a stabilitása vagy enzimaiikus tulajdonságai javuljanak. A reakció két komponensének a koncentrációja szeles határok között változhat, mint azt az alábbiakban kifejtjük. A szubsztrát-komponens kiindulási koncentrációja előnyösen 0,01 és 1 mól, míg az amin-komponensé 0,05 és 3 mól között van. Az enzimaktivitás is sokféle lehet, előnyösen azonban 10'e és 10"4 mól között alkalmazható. A találmány szerint a hőmérséklet előnyösen 20-50 °C. Adott szintézishez a legmegfelelőbb reakció-hőmérséklet kísérletekkel határozható meg, de nagymértékben függ az alkalmazott amin-komponenstől és enzimtől is. A megfelelő hőmérséklet rendszerint 35-45 °C. előnyösen 35 °C körül Van. 20 °C alatti hőmérsékleten végzett reakció ideje aránytalanul megnő, míg az 50 °C felett végzett reakcióknál problémát jelenthet az enzim és/vagy a reakciópartnerek vagy a reakciótermék stabilitása. Hasonló eltérések tapasztalhatók a reakcióidőkben is, amelyek nagymértékben függnek egyéb reakció-paraméterektől. A találmány szerinti eljárás standard reakcióideje kb. 10 perc, de elhúzódhat néhány órára is. Meg kell jegyeznünk, ha egy amidot vagy szubszíiluált amidot használunk amin-komponensként, akkor előnyös vagy éppen szükséges lehasítani az amid-csoportot a képződött pcptid-amidról, hogy a szintézis tovább folyhasson. Ebben a tekintetben a karboxipeptidázok, különösen a CPD-Y rendkívül megfelelőek, mivel a korábban leírt CPD-Y pH > 9 értékeken amidáz-aktivitást mulat, ugyanakkor a karboxipeptidáz aktivitása elhanyagolható. A karboxipeptidázok általában a keletkezett peptidek R3 vagy R4 ( jelentésük azonos a korábban megadottakkal) csoportjinak hasítására használhatók, amikor kívánatos a reakció folytatása vagy éppen egy C-terminálisan nem védett pepiid előállítása. Mint majd a későbbi példák is mutatják, a találmány szerinti eljárás alkalmazható korlátlan számú dipeptid, oligopeptid és polipeptid előállítására, azonos találmányi elv alapján, amikor is a szubsztrát-komponenst egy aminosav vagy aminosav-származék formájában levő amin-komponcnssel, karboxipeptidáz jelenlétében rcagállatjuk. llv módon jól ismert oligopeptideket vagy polipeptideket állíthatunk elő, például enkefalinokat, szomastatint, szomastatin analógokat vagy hasonló tulajdonságú peplidekel. mint az úgynevezett „álom peptidet” (Trp-Ala-Cüy-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu). Bizonyos esetekben, amikor több mint öt aminosavból álló peptideket állítunk elő, előnyös a kívánt pepiid részeit oligopeptídek fragmenseiből, például egy megfelelő aminosav-szckvenciájú pentapeptidből szintetizálni és az oligopeptidet a fragmensek ismert módon történő kondenzációjával előállítani. A keletkező peptidek oldékonysági tulajdonságainak javítása céljából előnyös, ha a reakciólépések során N-terminális aminosavkent argínint vagy más ionizálható aminosavat használunk és ezután az arginint a peptidről cs specifikus enzim, például tripszin segítségével lehasítjuk, amikor a kívánt aminosav szekvenciája egyébként megfelelő. Ezek és az egyéb módosítások szintén a találmány tárgyát képezik. Mielőtt a találmány szerinti eljárást példákkal bemutatnánk. ismertetjük a kiindulási anyagokat, mérési módszereket stb. Kiindulási anyagok A karboxipeptidáz Y-t pékclesztőből izolálták affinitáskropiatográfia alkalmazásával (Johansen, J. T., K. Breddam. M. Ottesen; Isolation of carboxypeptidase Y by affinity chromatography.. Carlsberg Res. Commun. 41, 1-14. 1976). és amelyet liofilizált por formájában alkai máztunk (10 % enzim nátrium-citrátban). Felhasználás előtt az enzimet Sephadcx® G-25 fine (1,5x25 cm) oszlopon sóialanítottuk és desztillált vízzel eluáituk. Az enzimkoncentrációt spektrofotometriásán határoztuk meg l-l % nm = 14.8 érteknél (Johansen, j. T,, K. Breddam. fCi. Ottesen: Isolation of carboxypeptidase Y by atünity chromatography, Carlsberg Res. Commun. 41, 1-14, 1976) 7 mg/inl koncentrációjú törzsoldatot (MO p.mó!) készítettünk, es 250—500 gtl-es mennyiségekben —2 i cC-oti tároltuk. A benzoilalamin-metilésztert (Bz-Ala-OMc) a Bachem cégtől (Lieastal, Svájc) vásároltuk. A bórtrifluorid-éterát-komplexet (a szintézishez), oldószereket és reagenseket (valamennyit analitikai minő5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
