186734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek enzimatikus előállítására
1 186 734 2 XV. táblázat Karboxipeptidáz-Y-nal katalizált pepticlszintézis 50 mmólos Bz-Ala-OMe-bő! és felsorolt aminosav-észterekből polict'lénglikolra 30 %-os, KCI-re 0,1 mólos és EDTA-ra 1 mmólos oldatban A reakció jellemzői: CPD-Y — 8 /imól, pH = 9,6 és 25 °C Szubsztrát Amin-komponens Termék Kitermelés (konc.) (konc.) % Bz-Ala-OMe Valin-OMe (0,5 mól) Bz-Ala-Val-OH 1 88 (50 mmól) Bz-A)a-Val-Val-OH j Szerin-OMe (0,5 mól) Bz-Ala-Ser-OH 30 Glutaminsav-fy-OBut)Bz-Ala-Glu-38-OMc (0,5 mól)-(y-OBut)-OH Fenilalanin-OMe Bz-Aia-Phe-OH 82 (0,5 mól) Bz-AIa-Phe-Phe-OH L-Metionin-OMe Bz-Ala-Met-OH 85 (0,5 mól) Bz-Ala-Met-Met-OH Bz-Ala-Met-Met-Met-OH D-Mctionin-OMe (0,5 mól) Bz-Aia-D-Met-OH 0 17. példa Nem oldható (immobilizált) karboxipeptidáz-Y 30 A CPD-Y-t Concanavalin A-Sepharose 4B-hez (Pharmacia Fine Chemicals) kapcsoltuk, majd a CPD-Y-t és Concanavalin A-t Hsiao és Royer módszere alapján (Archives of Biochemistry and Biophysics, 198. 379- 385, 1979) glutáraldchiddel térhálósítottuk. A CPD-Y koncentrációja 3 mg volt 1 ml csomagolt Sepharose-ra számolva. Az 1. és 3. példában leírtakhoz hasonló módon állítottuk elő a XVI. táblázatban felsorolt peptidelcet, a következő paraméterek mellett: 50 mmól szubsztrát, 0,25 ml CPD-Y gél (5 /xmól CPD-Y). pH = 9,7 és 35 °C. Az enzim szűréssel történő eltávolítása után a terméket és 35 kitermelési GPLC módszerrel határoztuk meg. A' VI. táblázat Nem oldható karboxipcptidáz-Y által katalizált pepiidszintézis Szubsztrát Amin-komponens Termék Kitermelés (konc.) (konc.) % Bz-Ala-CMe Fenilaianin (0.15 mól) Bz-Ala-Phe 21 (50 mmól) Leucin-amid (0.2 mól) Bz-Ala-Leu-NHj 91 18. példa Bz-Ala-Lcu-NH2-re 5 mmólos, KCI-re 0,1 mólos. EDTA- ra 1 mmólos, dimetil-formamidra 10 %-os oldatot 10,0 pH-értékné! 25 °C hőmérsékleten összekeverünk 0.25 mól valin-amiddal. A reakciót 40 /orról CPD-Y adagolásával indítottuk be és a 3. és 4. példában leírtak szerint folytattuk le. A Bz-Aía-Leu-Val-Bl l2-t nagynyomású folyadékkromatográfiásán izoláltuk 65 %-os kitermeléssel. Az eljárás! megismételtük, azzal az eltéréssel, hogy szubsztrát komponensként 5 mmól Bz-Ala-Phe-NH2-t alkalmaztunk. így nagynyomású folyadékkromatográfiásán 44 %-os kitermeléssel izoláltuk a Bz-Ala-Phc-Val-NH2-t. Szabadalmi igénypontok I. Eljárás A—B általános képletű — mely képletben 55 A jelentése N-terminálisan védett L-aminosav-gyök vapv C-terminális L-aminosavvai rendelkező, adott esetben N-tcrminálisan védeti peptid-gyök és B jelentése adott esetben C-terminálisan védett L-aminosav-gyök — 60 2-6 tagú pcplidck előállítására valamely szubsztrátkomptrnensnek egy amin-komponensscl enzim jelenlétében történő reakciójával, azzal jellemezve, hogy szubsztrát komponensként az alábbi vegyületek vala- 65 melyikét 18
