186734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek enzimatikus előállítására
1 I 86 734 2 A találmány tárgya eljárás peptklck enzimatikus előállítására. Részletesebben, a találmány tárgya egy eljárás peptidek előállítására, mely során katalizátorként az enzimek specifikus csoportjait alkalmazzuk. Ismeretes, hogy a peptidek szintéziseinél többé vagy kevésbe bonyolult kapcsolási reakciókat végeznek, mind a heterogén, mind a homogén fázisban végzett szintézisek esetében. Azonban mindezek a kémiai módszerek nemkívánt másodlagos reakciók vagy racemizációk bekövetkezésének kockázatával járnak és ezért szükséges a kémiai reakciók gondos ellenőrzése, hogy a fellépő problémákat csökkentsük vagy kiküszöböljük. Továbbá, az aminosav oldalláncait gyakran védeni kell, amely szükségessé teszi a védőcsoportok eltávolítását is utolsó lépésként, hogy a kívánt pep'idet előállítsuk. A szintetizált pepiidtől függően, a kitermelés alacsony lehet és a másodlagos reakciók gyakran szükségessé teszik a nehézkes tisztítási művelet elvégzését, hogy a pepiidet tiszta formában kinyerjük. A kémiai úton történő peptidszintézis mindezen velejáró problémái, valamint a kapcsoló reagensek és blokkoló aminosav-származékok legtöbbjének magas ára azt jelenti, hogy még egy kisebb szintetikus peptid, például pentapeplid előállítása is viszonylag költséges. Mivel az. enzimek igen specifikus katalizátorok és a proteolitikus enzimek hidrolizálni képesek proteinekben a peptidkötcseket, korábban kísérleteket végeztek a hidrolízis reakciójának visszafordítására, vagy más szavakkal, az enzimek katalizátorként történő alkalmazására a peptidkötések szintézisénél. Bergmann és Fraenkel-Conrad (The role of specificity in the enzymatic synthetis of protein: J. Biol. Chem. 119, 707-720, 1937), valamint Bergmann és Fruton (Some synthetic and hydrolytic experiments with Chymotrypsin; J. Biol. Chem. 124, 321-329, 1938) részletes vizsgálatokat folytattak ezen a téren és 1937-ben kimutatták, hogy a papain és kimotnpszin bizonyos aciiaminosavak és aminosav-anilidek kapcsolási reakcióját katalizálhatják. Ezeket a vizsgálatokat később tovább folytatták cs két alapvetően eltérő közelítési mód (a termodinamika és kinetika) alapján intenzifíkálták. A termodinamikai módszerek alapvető jellemzője, hogy a reagensek közötti termodinamikai egyensúly beállását megfelelő proteáz alkalmazásával katalizálják és a reakciótermékeket a reakcióelegyből eltávolítják. Ily módon Isowa és társai (The synthesis of peptides by means of proteolytic enzymes; Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2762-2765, 1977, The enzymatic synthesis of protected valinc-5 angiotensin II amide-1; Bull. Chem. Japan 50, 2766-2772, 1977., Peptide synthesis with proteinases, Fragment condensation of ZLeuGInGlyOH or ZGInGiyOH with HLcuVaINH2 using metalloproteinases; Bull. Chem. Soc. Japan 51, 271-276, 1978). továbbá 4 119 493 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és 1 523 546, valamin! I 533 129. sz. Nagy-Briíannia-i szabadalmi leírások, Luisi és társai (Co-oligopeptídes of glycine and aromatic amino acids w'ith variable distance between the aromatic residues; J. Moi. Catalysis 2, Í33-138, 1977. Co-oligopeptidcs of aromatic amino acids and glycine with variable distance between ihc aromatic residues; Biopolymers 16, 631-638. 1977 ) cs Morihara (Peptide bond synthesis catalyzed by nlpha-cbymotrypsin; J. Biochem 84, 1277-1283, 1978) leírják, hogy számos szerin-, tiol- és metalo-endoproteáz katalizálja a peptidszintézist a védett, de könnyen oldódó di-, tri- és tetrapeptidekbői, feltéve, ha a végtermék kicsapódik a reakcióközegből, amikor is annak oldhatósága kisebb, mint az egyensúlyi koncentráció. Fenti szintézisek példáit az alábbi reakcióvázlaton szemléltetjük: !. Z-l.cu-Phc-OH rPhe-ODPM E2£2|g.Z-Leu-Plic-Phe-ODPM ODPM = difenil-metíl-észter 2. Z Arg(N02)-OH + Phe-Val-OBut ‘HTMÍÍ25ftZ-Arg(N02)Phc-Va!-OBut 3. BOC-Val-Tyr(Bz)OH+Val-His(Bz)-Pro-Phe-OF:t BOC-Val-Tyr(Bz)-Val-His(Bz)-Pro-Phe-OH Z — benziloxikarbonÜ Bz = benzoil BOG = tercier-butíloxi-karboxil Azonban ez a reakcíőeimélet csak akkor használható a szintézis általános módszereként, ha a hagyományos kémiai kapcsolási módszerekhez hasonlóan valamennyi aminosav oldalláncot a reakció előtt ionizálható csoportokkal védenek és a reakció végen azokat eltávolítják. A módszer hiányossága, hogy a különböző nagy specifikussággal rendelkező enzimek kiválasztása a szintetizálandó peptidkötések típusainak megfelelő nehézkes. Bár ezek a hiányosságok áthidalhatóak, de a módszernek számos egyéb hátránya is van, mivel igen magas enzimkonccntráció (100 mg/mmo! peptid), hosszú reakcióidő (1-3 nap) szükséges és a kitermelés is ingadozó (fenti amerikai egyesült államokbeli és Nagy-Britannia-i szabadalmakban 20 és 80 % között). Klibanov cs társai (A new' approach to preparative' enzymatic synthesis; Biotech. Bioeng. 19, 1351—1361, 1977) javasolták a vízből és vízzel nem elegyedő szerves oldószerből álló rendszer alkalmazását. Ez a módszer hasonlóan magas enzimkoncentrációt és több napig is elhúzódó reakcióidőt igényel. Az enzimatikus szintézisek másik típusa a reakciókinetika felhasználására támaszkodik, A legtöbb szerin- és tiol-proteáz esetében egy ncil-enzim intermediert képeznek a katalitikus lépések egyikében a peptid és peptidészterek hidrolízise folyamán, amelyet ezután a következő lépésben vagy lépésekben hidrolizáinak. Ha vízen kívül más nitkleofil-rész is jelen van a hidrolízisnél, akkor azok szintén átveszik az aci!-enz.imről az acilcsoportot, amely az amidkötés kialakulásához vezet. Fastrez és Fersht (Demonstration of the acyl-enzyme mechanism for the hydrolysis of peptides and anilides by chymotrvpsin: Biochemistry 12, 2025—2034,-1973) leírják az N-acetil-L-fcnil-alanin (Ac-Phc-OEt) kimotripszin által katalizált hidrolízisét különböző aminosav-nmidok jelenlétében. A reakciót az 1. reakcióvázlaton mutatjuk be. 5 1G 15 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 65 2
