186566. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminosavak, peptidek, fehérjék és szénhidrátok immobilizálására
1 186.566 A találmány tárgya eljárás amlnosavak, peptidelc, fehérjék és szénhidrátok immobilizálására kinonnal aktivált karbonsavam id-csoportot tartalmazó polimerek segítségével. Az elmúlt években számos eljárás dolgoztak ki kis molekulasúlyú vegyületek, valamint biopolimerek, például fehérjék' szilárd fázisú hordozón történő * unmobilizÁására (vA Zaborsky, C.R. /1973)/ ft "immobilized Enzymes" /West, R.C. szerkesztésében), * CRC Press, Cleveland, Ohio; Chibata, I. /1978/ "immobilized Enzymes /Chibata, I. szerkesztésében), 9-107. oldalak, Kodansha Ltd., Tokyo; Gold-^ stçin, Mane eke, G. /1979/ "Applied Biochemistry Vf 5i(,d ’ ^engineering" /Wingard, L.B., Katchalski-Katzier, E. és Goldstein L. szerkesztésében/, 1. kötet, 23-126. oldalak, Academic Press, Inc., New eljárások általános hátrányait az alábbiakban foglalhatjuk össze: — speciális reakciókörülményeket igényelnek, — egy részüknél a hordozó és a ligandus közötti kötés kialakítása speciális kapcsoló reagenst igényel, — a kapcsoló reagensek közül egyesek (ml. a tiofoszgén) rendkívül toxikusak, ezért alkalmazásuk külön óvintézkedéseket igényel. Az ismertetett hátrányok kiküszöbölése céljából annak lehetéségét, hogy aminosavak, peptidek, fehéqék és szénhidrátok kovalens kötésén keresztüli immobilizálását egyszerű feltételek között, lényegesen kevésbé toxikus aktiválószerrel, könnyen hozzáférhetővé, ipari méretekben is gyártható, előnyös tulajdonságó hordozókon valósítsuk meg. A találmány alapja az a meglepő felismerés, hogy az akríiamid-poliinerek amidcsoportjaikon kölcsönhatásban lépnek a kinonokkal, és az így keletkező aktíváit polimerek kovalens kötéseken keresztül képesek amínosavakat, peptideket, fehéijéket és szénhidrátokat megkötni. Ez a felsimerés azért meglepő, mert a karbonsavamidok általában, kevésbé reakcióképes vegyületek, és így eddigi ismereteink szerint nem volt várható, hogy kinonokkal reakcóba lépnek. A találmány értelmében az aminosavak, peptidek, fehétjék és szénhidrátok immobilizálását két lépésben végezzük el: 1. Az akrilamid-polimert bármilyen pufferben (kivéve az amin-, szulfhidrii- és/vagy hidroxil-csoportokkal rendelkező vegyületeket tartalmazó puffereket), amelyek pH-ja 3-11, célszerűen pH = 6-8, duzzasztjuk, majd a kínon - célszerűen p-benzokinon — bármilyen, vízzel elegyedő szerves oldószeres - célszerűen etilalkoholos vagy dioxáns - oldatát adjuk hozzá. Az elegyben a kinon végkoncentrácíója 2-100 millimól, célszerűen 40-60 míllimól. Az aktiválás 273-343 K-on történik, célszerűen 20%-os vizes dioxánnal, majd pufferes mosással távoiítjuk el. Az aktivált hordozó nedves állapotban vagy liofílizálva tárolható. 2. Az aminosavak, peptidelc, fehérjék, illetve szénhidrátok immobilizálását pH = 3 — 11 tartományban végezzük, a megkötendő vegyület stabilitásától függően, célszerűen pH * 6-8 között. Az aktivált gélhez a kis (10.000 Dalton meg nem haladó) molekulatömegű megkötendő anyagokat 0,001-1,- mólos, célszerűen 0,01 mólos oldatban, a makromolekuláris (10.000 Daltonnál nagyobb molakulatömegű) megkötendő anyagokat pedig 3-100 mg/ml-es, célszerűen 20 mg/mi-es oldatban adjuk. A kapcsolási reakciót 273-313 K-en, célszerűen 260-28- K-en; a reakcióidő rendszerint 24 óra. A meg nem kötött anyagokat pufferes, illetve 1,0 mól nátrium-kloridoi: tartalmazó pufferrel történő mosásokkal távoiítjuk el. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következőkben foglalhatók össze:- a képződött kötés stabil,- az eljárás könnyen hozzáférhető anyagokkal végezhető el,- a hordozók széles körére kiterjeszthető,- széles pH-tartományban alkalmazható módszer. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A példákban említett Akrilex P típusú gélek a Reanal Finomvegyszergyár (Budapest) gyártmányéi. 1. példa 30 g Akrilex P-100 xerogélt (akrilamíd — N,N'-metilén-bisz-akril-amicl kopolimer) 1200 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferben (pH = 8,0) szuszpendáltatunk, hozzáadtuk 0,25 mólds p-benzokinon 20%0os vizes dioxánnal készített 300 ml mennyiségű oldatát, majd a szuszpenziót 24 órán át 323 K-en tartottuk. Ezután a duzzadt gélt elválasztottuk és 3 liter 20%0os dioxánnal, ezt követően pedig 10 liter desztillált vízzel mostuk. A kimosott gélt lioftlizáltuk. Kitermelés: 24,3 g aktivált hordozó. 2. példa 0,1 g Akrilex P-100 xerogélt (akrilamid NX-metilén-bisz-akrilamid kopolimer) 4,- ml 0,1 mólos foszfát pufferben (pH * 8,0) szuszpendálunk, hozzáadtuk 0,25 mólos p-benzokinon 20%-os dioxánnal készített 1,0 ml mennyiségű oldatát, majd a szuszpenziót 24 órán át 323 K-en tartottuk. Ezután a duzzadt gélt elválasztottuk és 70 ml 20%0os dioxánnal, ezt követően pedig 70 ml desztillált vízzel mostuk. Az aktivált gélt vákuuniszűrőn szűrtük, majd hozzáadtuk 2,0 ml 0,01 mólos gamma-amino-vajsav oldatot. A gamma-amino-vajsav oldásához 0,1 mólos kálium-nátrium-foszfát puffert (pH = 7,5) használtunk. A szuszpenziót 24 órán át 277 K-en inkubáltuk, majd a gélt elválasztottuk és a nemkötött gamma-amino -vajsavat 1,0 mól nátrium-kloridot tartalmazó 0,3 mólos nátrium-acetát pufferrel (pH = 5,0), illetve 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonát oldattal (pH = 8,5) történő mosásokkal távolítottuk el. A kötött gamma-amino-vajsav menynyisége 4 mikromól volt, ami a reakcióeíegybe vitt gamma-amino-vajsav mennyiség 20%-a. 3. példa 0,1 g Akrilex P-100 xerogélt (akrilamid-N,N'-metílén-bisz-akrilamid kopolimer) 4,0 ml 0,1 mólos foszfát pufferben (pH = 8,0) szuszpendáltunk, hozzáadtuk 0,25 mólos p-benzokinon 20%-os dioxánnal készített 1,0 ml mennyiségű oldatát, majd a szuszpenziót 24 órán át 323 K-en tartottuk, Ezután a duzzadt gélt elválasztottuk és 70 ml 20%-os dioxán-nal, ezt követően pedig 70 ml desztillált vízzel mostuk. Az aktivált gélt vákuumszflrőn szűrtük, majd hozzáadtuk 2,0 ml 20 mg/ml-es marha szérumalbu-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
