185677. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kalmodulin előállítására vörösvérsejtekből
1 185677 2 igényes elkülönítést. Ezért egyszerű és olcsó, aminek révén a kalmodulin nagy mennyiségben való előállítását is lehetővé teszi. c) A kalmodulin natív formájának kinyerését eredményezi, amelyet egyszerűen és gyorsan meg lehet tisztítani az egyéb, hőre kicsapódó fehérjéktől. d) A termék az olcsó előállítási eljárás ellenére eléri az irodalom szerinti maximális aktivitást és tisztaságot. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa ' Kiindulási anyagként két zsák, egyenként 400 ml savanyú cítrát-dextróz (ACD) oldatban tartósított humán vérkészítmény hulladékként megmaradt vörösvérsejt koncenírátumát használjuk. A vörösvérsejt-üledéket háromszor mossuk 0,16 mól/1 NaCl oldattal, egyenként tíz percig tartó, 2500 g-vel végzett centrifugálásokkal. A tömény vörösvérsejt masszát (600 ml) desztillált vízzel 5000 ml-re kiegészítjük, majd 5 percig tartó hemolizáiás után a hemolizátumot 8-rétegű gézpólyán átszűrjük. A szűrlethez 4 g DEAE Sephadex A 50 anioncserélő gyantát (Pharmacia, Uppsala, Svédország) adunk, amelyet előzőleg 100 ml 0,16 mól/1 KC1+ 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5 -ős pufferoldattal ekvilibráltunk gs vákuum alatt kilevegőztettünk. Az oldat pH-ját 10%-os ecetsavval 6,5-re állítjuk, majd 30 percig szobahőmérsékleten kevergetve állni hagyjuk. A Sephadex-szel elkevert hemolizátumot 10 cm átmérőjű G 1-es üvegszürőn átszűrjük, és a szűrőn fennmaradó Sephadex-et folyamatosan mossuk először 1 liter 0,16 mól/1 KC1+16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldattal, majd a gél teljes kifehéredéséig kb. 1 liter 0,32 mól/1 KC1+ 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldattal. A kalmodulint tartalmazó fehérje frakciót 250 ml 0,64 mól/1 KC1+ 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldattal eluáljuk. Az eluátumot 5 percig 90 °C-on hőkezeljük, majd a lehűtött oldatból kicsapódó fehérjéket 10 percen át 4000 g-vel végzett centrifugálással kiülepítjük. A felülúszót desztillált vízzel négyszeresére hígítjuk, majd 0,5 g 0,16 mól/1 KC1 + 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldattal ekvilibrált és vákuumban kilevegőztetett DEAE Sephadex A 50 anioncserélő gyantát adunk hozzá. 30 percig szobahőmérsékleten kevergetjük, majd 2x5 cm-es kromatografáló oszlopba töltjük. Az oszlopot 3 oszloptérfogat 0,16 mól/1 KC1+ 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös, ill. ezután 0,32 mól/1 KC1+16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldatokkal mossuk. A mosást minden esetben addig folytatjuk, amíg a frakciók 280 nm-cn mért abszorpciója 0,020-nál kisebb nem lesz. A tisztított kalmodulint 12 ml 0,64 mól/1 KC1+16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldattal eluáljuk. A 12 ml kalmodulin-íartalmú oldatot 17 mmól/1 imidazol-HCl + 50 mmól/1 CaCl2 pH 7-es pufferoldattal ekvilibrált Sephadex G 100 oszlopon gélszűréssel sómentesítjük és utótísztítjuk. Az oszlop mérete: 2 ci» x 70 cm; a pufferoldat átfolyási sebessége: 50 ml/óra; az egyes frakciók térfogata: 3 ml. A kalmodulin-aktivitással rendelkező frakciókat (kb. 30 ml) összegyűjtjük és liofilizáljuk. Az így kapott készítmény nátrium-dodecil-szulfát (SDS) gél-elektroforézissel vizsgálva a kalmodulin 17 000-es mólsúlyának megfelelő helyen standard fehérjékkel ellenőrizve egy fehérjecsíkot ad. A készítmény biológiai aktivitását vörösvérsejt membrán kalcium-transzportjára kifejtett aktiváló hatással mérjük. Irodalmi adatoknak megfelelően (ScharíT O., Cell Calcium 2, 1 -27 (1981)) a tisztitett kalmodulin 20-50 nmól/g membrán fehérje arányban fejt ki 50%-os aktivitás-növekedést (K0 5). 500 g vörösvérsejtből 7 mg kalmodulint kapunk, ami 30%-os kinyerésnek felel meg. 2. példa Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azonban kiindulási anyagként citrát-oldattal frissen levett 1 liter marhavért használunk. A kalmodulint az 1. példában megadott azonos tisztaságban 26%-os hozammal kapjuk. 3. példa Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a szűrt hemolizátumhoz 20 g DEAE cellulózt adunk, amelyet előzőleg savval és lúggal ciklizáltunk, majd 100 ml 6,5-ös pH-jú pufferoldattal (0,16 mól/1 KC1+ 16 mmól/1 imidazol-HCl) ekvilibráltunk. Az oldat pH-ját 10%-os ecetsavva! 6,5-re állítjuk be, majd az oldatot 30 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A DEAE cellulózról a hemolizátumot dekanráljuk, majd a gélt 10 cm átmérőjű, szűrőpapírral kibélelt porcelán szűrőbe öntjük. A továbbiakban az I. példa szerinti módon járunk el. A kapott termék hozama és tisztasága azonos az 1. példában megadottal. 4. példa Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy az első DEAE Sephadex batch-adszorpciót követően a kalmodulint tartalmazó eluátumot 15 percig hőkezeljük 80 °C-on. A kapott termék hozama és tisztasága azonos az 1. pé'dában megadottal. 5. példa Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a második DEAE Sephadex batch-adszorpciót követően a kalmodulint 0,55 mól/1 KC1+ 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5- ös oldattal eluáljuk. A terméket 24%-os hozammal kanjuk. Tisztasága megegyezik az 1. példában megadottal. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
