185668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulinok B-30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére
185668 mazhatók kiindulási anyagként a helyettesítési reakcióban. Más enzimeket is használhatunk, mint azt később leírjuk. A találmány szerinti eljárás egyszerűsége valóban meglepő, még a PCT/DK80/0Û020. számú szabadalmi bejelentés és a 3276961. számú amerikai egyesült állomokbeli (Bodanszky-féle) szabadalmi bejelentés ismeretében is, mivel joggal várható volt, hogy nemcsak a B—30 aminosavat, hanem az A—21-aszparagint is — ami az összes említett inzulinban közös — megtámadja az enzim. A fent említett korábbi szabadalmi leírásokban a kívánt enzimatikus jellemzőket általános peptidszintézisre való tekintettel írták le részletesen, és azt állították, hogy a karboxipeptidázok többsége különböző enzimatikus aktivitást mutat, ami erősen függ a pH-tól, például bázikus közegben pH 8 és 10,5 között túlnyomóan észteráz vagy amidáz tulajdonságuk ér vényesül, pH 9 és 10,5 között nem, vagy csak jelen téktelen karboxipeptidáz aktivitásuk van, ami azon ban egyre kifejezettebbé válik, ahogy a pH 9 alá csökken. Jelen összefüggésben az észteráz aktivitás kevés bé jelentős, de egyébként ezeket a tulajdonságokat előnyösen lehet alkalmazni a találmány szerinti eljárásban, mivel ezek közrejátszanak abban, hogy az egy lépéses eljárást jó hozammal lehessen megvalósítani. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható karboxipeptidázok L-specifikus szerin- vagy tiolkarboxipeptidázok. Ilyen enzimeket az élesztőgombák termelnek, de lehetnek állati, növényi vagy mikrobás eredetűek is. Különösen előnyös az élesztőgombából származó karboxipeptidáz Y (CPD—Y) enzim. Ezt az enzimet már leírták az előző bejelentésekben, többek között utalnak Johansen [Carlsberg Res. Comm. 41, 1 (1976)] és munkatársai cikkére, akik különösen előnyös tisztítási eljárást dolgoztak ki, az enzimet affinitási kromatográfiás módszerrel tisztítva, műgyanta hordozóból és az ahhoz kapcsolt benzil-szukcinilcsoportokból álló gyantaágyon. A CPD—Y-ra — ami egy szerin-enzim — jellemző, hogy pH 9-en különböző, fentebb említett enzimaktivitásokkal rendelkezik, és nincs endopeptidáz aktivitása. A CPD—Y másik előnye, hogy nagy mennyiségben előállítható és viszonylag nagy stabilitású. További részletek a következő irodalmi helyeken találhatók: Widmer, F., Johansen, J. T.: Carlsberg Res. Commun., 44, 37 (1979) és Breddam, K., Widmer, F., Johansen, J. T.: Carlsberg Res. Comm. 45, 237 (1980). A CPD—Y mellett a jelen találmány szerinti eljárás más, alább felsorolt karboxípeptidázokkal is kivitelezhető: Enzim Penicillokarboxipeptidáz S—1 Penicillokarboxipeptidáz S—2 Karboxipeptidáz(ok) Karboxipeptidáz(ok) Karboxipeptidáz(ok) C Eredet Gomba Pénicillium janthinellum Pénicillium janthinellum Aspergillus saitoi Aspergillus oryzae Növény narancslevél narancshéj Karboxipeptidáz Q, Citrus natsudaidai Hayata Phaseolain zöldbablevél Karboxipeptidáz(ok) csírázó árpa csírázó gyapot 5 paradicsom görögdinnye Bromelain (ananász) por A fenti karboxipeptidázok közötti rokonságot Ku! o bota és munkatársai [J. Biochem. 74, 757 (1973)] vizsgálták. A találmány szerinti eljárás elvileg bármely természetes, félszintetikus vagy szintetikus eredetű inzulin’' szubsztráttal kivitelezhető. i b Megjegyezzük, hogy az inzulin kiindulási anyagot alkotó egyes aminosavakban jelenlévő ionizálható csoportok kívánt esetben önmagában ismert módon védhetők, a csoport jellegétől függően. Azonban ez egyáltalán nem szükséges, éppen ez a jelen eljárás 20 egyik előnye. Ha mégis bizonyos okokból védeni kell a funkciós csoportokat, a fent említett szabadalmi leírásokban, különösen a WO 80/02151. számú szabadalmi leírásban találhatunk alkalmas védőcsoportokat. 25 A reakció másik résztvevője az úgynevezett aminkomponens, ami egy a) H-B-NH2 általános képletű aminosav-amid — a képletben B aminosav-maradékot jelent — 30 b) H-B-OR3 általános képletű aminosav-észter — a képletben B aminosav-maradékot jelent, R3 jelentése alkil-, cikloalkil-, aril-, heteroaríl-vagy aralkilcsoport — jf: lehet. Az amin-komponensként említett aminosav bármely ismert természetes aminosav lehet, így például leucin, izoleucin, alanin, glicin, szerin, valin, treonin, lizin, arginin, aszparagin, glutamin, glutaminsav, me, tionin, fenilalanin, tirozin, triptofán, vagy hisztidin. Alkilcsoporton egyenes vagy elágazó szénláncú, előnyösen 1—6 szénatomos alkilcsoportot — például metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, terc-butilamil- vagy hexil csoportot — értünk. A cikloalkiícsoport 3—8 szénatomos cikloalkilcsoportot jelent, például ciklopropil-, ciklobutilcsoportot és így tovább. Arilcsoporton előnyösen fenilcsoportot értünk. Az aralkilcsoport benzil-, fenetilcsoportot vagy havti sonló csoportokat jelent, Heteroarilcsoport alatt például piridil-, pirrolidil-, pirimidinil-, morfolinil-, pirazinil- vagy imidazililcsoport értendő. Az összes fenti csoport szubsztituálható az enzim szempontjából közömbös szubsztituensekkel, például halogénatommal (fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal), nitrocsoporttal, alkoxicsoporttal (metoxi-, etoxicsoporttal), vagy alkilcsoporttal (metil-, etilcsoporttal). r)U Az -OR3 csoport előnyösen alkoxicsoportot, például metoxi-, etoxi-, vagy terc-butoxi-csoportot, fenoxi-vagy benzoxicsoportot jelent. A csoportok adott esetben közömbös szubsztituensekkel, például nitrocsoporttal (p-nitro-benzoxi-csoport) lehetnek lj: szubsztituálva. 4
