185603. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rosszindulatú daganatos sejtek kimutatására
1 185 603 2 ták felvitele után a lemezeket visszahelyezzük a készülékbe és az oldószertartályt a géllel összekötő papírcsíkot kissé lefelé toljuk, hogy a gélréteggel jó érintkezést biztosítsunk. A papírcsíknak nem szabad csöpögni. A felesleges nedvességet letöröljük. Az oldószert a tartályban 5 állandóan az edény felső végétől számított 1 cm magasságig tartjuk. A futtatást 4—7 óra hosszat végezzük aszerint, hogy a szétválasztás hogy halad. Színes anyagokkal közvetlenül végbemegy a szétválasztás. A protein szétválasztott foltjait könnyen láthatóvá tehetjük oly 10 módon, hogy a vékonyrétegkromatográfia lemez papír másolatára visszük át a kromatográfiás szétválasztás befejezése után és ami után metanol + víz + ecetsav = = 90:5:5 arányú elegyében 48 óra hosszat előmostuk. A papírlap 3 mm-es szűrőpapír. 20X18 cm-es papírlapot 15 helyezünk a gélrétegre és annyira nyomjuk, hogy a gélréteggel való érintkezést biztosítsuk. Ügyelünk arra, hogy a papírmásolat alá ne kerüljön levegő és hogy ne sértsük meg a gélréteget. A folyadékfázist a papírral lehatjuk a gélrétegről és egy perc múlva eltávolítjuk, majd 20 60 C-on 15 percig azonnal szárítani kezdjük egy kemencében és bármely szokásos festési módszerrel megfestjük. A festést úgy végezzük, hogy a papírmásolatot 0,03% diazotált szulfanilsav 10%-os nátrium-karbonáttal (Pauley-reagertssel) készített oldatával beperme- 25 tezzük. A megfestést végezhetjük amido-fekete metanol-ecetsav 90:10 V/V arányú elegyére telített oldatával is, a festési idő 5-10 perc. Az elszíntelenítéshez a lemezt átöblítjük két térfogatnyi 90 :10 arányú metanol-ecetsav- 30 oldat és egy térfogatnyi víz keverékével. Alapos mosás nélkül nehéz kismértékű háttér festést kapni. A lemezeket magukat is 60 °C körüli hőmérsékleten száríthatjuk (levegő cirkulációval ellátott kemencében), de csak abban az esetben, ha csak az astrocytint kell megfesteni. 35 Izolációs célokra a lemezt csak levegőn kell szárítani szobahőmérsékleten. A túlfűtés hőbomlást eredményezhet, de ezt rendszerint elkerülhetjük, ha 50- 60 °C-on dolgozunk, ezen a hőmérsékleten a Sephadex G-200-as lemez 15-30 perc alatt szárad. A száraz lemezeket 40 10 percig metanol : víz : ecetsav 75 : 20:5 arányú elegyében hagyjuk duzzadni és amido-fekete azonos oldószerrendszerrel telített oldatában 5 óra hosszat festjük és utána azonos oldószer-rendszerben történő áztatással mossuk szárítás előtt. A molekulasúly-meghatározás úgy 45 történik, hogy a kiindulási vonal és az egyes zónák közepe közötti távolságot közvetlenül a másolaton vagy a denzitogrammon 0,005 mm-es pontossággal lemérjük. Az eredményt Rm értékben fejezzük ki, ez az érték a vizsgált protein migrációs távolságának (dp) aránya a 50 referencia proteinként használt citokróm C vagy mioglobin migrációs távolságához (dm). A vizsgált anyag migrációs távolságát elosztva a standard távolsággal adja az alábbi törtet: Egy egyenes kalibrációs vonalat kapunk, ha felrajzoljuk a standardok molekulasúlyának logaritmusát Rm függvényében. Ebből a vonalból megkaphatjuk az ismeretlen 50 protein molekulasúlyát. A legpontosabb eredményeket akkor kaphatjuk, ha a lemezre való felvitel előtt egyenlő rész proteinminta oldatokat elegyítünk a standardokkal, ez esetben citokróm C-vel. A fent leírt vékonyrétegkromatográfiás módszerrel az astrocytint körülbelül 65 0. 83 + 0,02 távolságra észleltük a standard citokróm C-hez viszonyítva önálló folt formájában és így az astrocytin molekulasúlyát hozzávetőleg 8000-nek találtuk. Ebben az eljárásban több különálló terméket sikerült elválasztani az astrocytintől a molekulasúlyok kisebb különbségei alapján. Három, eddig szennyeződésként szereplő hozzávetőlegesen 64 000, 148 000 és 230 000 molekulasúlyú terméket és egy alkalmanként előforduló 32 000 molekulasúlyú terméket mutattunk ki és választottunk külön a fent leírt vékonyrétegkromatográfiás módszerrel. Az astroeytin terméket az astrocytint tartalmazó géllel együtt száraz formában elválasztjuk, az 1. oldatban feloldjuk és a gyantától centrifugálással vagy más hasonló módszerrel választjuk el. Az így kapott astroeytin vízben, valamint semleges és savas pH-nál is oldódik, de lúgos pH-nál nem oldódik, abszorpciós csúcsot 280 mju hullámhossznál mutat. A termék 8000 molekulasúlyú polipeptid. Kovalensen kötőt: aminosavait 6 n sósavval történő hidrolízissel mutatjuk ki, majd a mennyiségi elemzés az alábbi aminosav összetételt mutatja: aszparaginsav Hozzávetőleges maradékszám 9 treonin 5 szerin 6 glutaminsav 13 prolin 4 glicin 6 alanin 9 valin 4 1/2 cisztin 2 metionin 1 izoleucin 2 leucin 8 tirozin 2 fenil alanin 3 lizin 8 hisztidin 2 arginin 4 összesen körülbelül: 88 A kimutatható mennyiségekből hiányzik a ciszteinsav, a hidroxi-prolin, a norleucin, az ammónia, az izodezmozin, a dezmozin, a hidroxi-lizin, lizino-norleucinsav és a gamma-ainincvajsav, de nyomokban jelen van glükózamin. A fenti módszerrel az 1. példában használt 11 g agytumor-szöveiből körülbelül 3 mg tisztított astrocytint sikerült előállítani. 2A. példa „Reeler” recognin előállítása A „Reeler” betegség genetikai betegség, melynél az állatoknak nem sikerül stabil koordinált mozgási aktivitást elérni, így tántorgó állapot jön létre, mivel bizonyos idegsejtek nem mozognak az agy meghatározott része, a kisagy felé egy bizonyos fejlődési szakaszban. Elektronmikroszkópos vizsgálatokkal kimutattuk, hogy egyes gliasejtek függőleges rúdszerű tengelyeket képeznek,
