185382. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén humán fibroblaszt-interferon előállítására
1 185 382 2 Met1-Ser-Tyr-Asn-Leus-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10-Arg-Ser- Ser-Asn-Phels-Gln-___-Gln-Lys19-___ Az interferonok vírusellenes, tumorgátló, növekedésgátló és az immunreakciót visszaszorító aktivitással rendelkeznek. Ezek a hatásterületek klinikai körülmények között még akkor is kimutathatók, ha az interferont viszonylag szennyezett, 1%-nál kisebb mennyiségű emberi interferont tartalmazó készítmények formájában, 1—10X106 egységnek megfelelő napi dózisban adják be a betegeknek. A találmány szerint előállított tisztított, homogén humán fibroblaszt-interferont az ismert interferon-készítményekhez hasonlóan használhatjuk fel a gyógyászatban; a dózist azonban a megnövekedett tisztasági foknak megfelelően csökkentjük. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Az egység/ml vagy egység/mg értékekben megadott interferon-faktorok az US National Institute of Health intézetben elhelyezett standard emberi leukocita-interi'eronra (GÛ23-901-527) vonatkoztatott adatok. Az egyes példákban kiindulási anyagként felhasznált nyers interferon-oldat előállítása Havell és Vilcek módszerével történik [Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2, 476-484(1972)]. Az egyes példák szerint felhasznált nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopok kereskedelmi forgalomban lévő termékek (gyártó cégek; ES Industries, Marlton, N. J. és Rainin, Piscataway, N. J., Amerikai Egyesült Államok). A difenil-csoportokkal módosított oszlopok a kereskedelemben nem szerezhetők be, ezért készítésüket a példákban ismertetjük. 1. példa Affinitás-kromatográfia concanavalin A-oszlopon 0,1 mól a-MM-t tartalmazó PPK-oldattal (pH = 7,2) egyensúlyba hozott 50 ml concanavalin A-sepharose 4B gélt porózus polietilén-lemezzel ellátott, 50 ml térfogatú polipropilén-oszlopba töltünk. Az oszlopra 180 ml/óra (35,5 cm/óra) átfolyási sebességgel 1,25 liter nyers interferon-oldatot (2X107 egység; fajlagos aktivitás 2X104 egység/mg) viszünk fel. Ezután az oszlopot 150 ml PPK- oldattal és 600 ml, 0,1 mól a-MM-t tartalmazó PPK- oldattal mossuk. Végül az interferont 50 térfogat % ■:tilén-glikolt tartalmazó, a fentivel azonos összetételű pufferoldattal eluáljuk. Az interferont 9%-os hozammal kapjuk (1,8X106 egység: fajlagos aktivitás: kb. 1X1Q7 egység/mg). További frakciók bevonásával, nagyobb sávszélességgel a hozam 15%-ra nőve Illető (3X106 egység; fajlagos aktivitás: 2-4X106 egység/mg). Nagynyomású folyadék-krotnatugráfia 8 :8 :20:64 térfogatarányú piridin-hangyasav-izopropanol-víz eleggyel („A” pufferoldat) előzetesen egyensúlyba hozott, 4,6X300 mm méretű oszlopba töltött, ciklohexilcsoportokat tartalmazó szilícium-dioxid-mátrixú adszorbensen (Chromegabond) 10 p) 0:4-0,8 ml/perc átfolyási sebességgel közvetlenül átvezetünk 120 ml, a concanavalin A-sephárose 4B-oszlopról elkülönített eluátumot (2,5X106 egység; fajlagos aktivitás: körülbelül 2-4X1Ü6 egység/mg). A maximális nyomást 306 4 atmoszféra értéken tartjuk. A nagynyomású folyadékkromatográfia során felhasznált rendszer lényegében megfelel a Bohlen és munkatársai által ismertetettnek [Anal. Biochem. 67, 438 (1975)]. 0,4 ml/perces átfolyási sebesség esetén a grádienselúciót a következőképpen végezzük: az „A” pufferoldatból indulunk ki, és ahhoz a következők szerint keverünk „B” pufferoldatot (piridin, hangyasav, izopropanol, n-butanol és víz 8 .'8 :25 .”20:39 térfogatarányú elegye): 0-25% „B” 32 perc; 25-60% „B”, 225 perc; 60-100% „B”; 63 perc. Az eluátumot 2,0 ml térfogatú frakciókba gyűjtjük. A 26-29. frakciót (2X106 egység) egyesítjük, 4 ml piridin-hangyasav eleggyel hígítjuk, majd közvetlenül felvisszük egy 4,6X X300 mm méretű, oktilcsoportokat tartalmazó szilicium-dioxid-mátrixú adszorbenssel (Chromegabond 10 p) töltött oszlopra. Az oszlopot a ciklohexilcsoportokat tartalmazó oszlopnál ismertetett körülmények között eluáljuk. Az aktivitási csúcs centrumában mért fajlagos aktivitás körülbelül 4X108 egység/mg a tisztított humán fibroblaszt-interferont 106 egységnek megfelelő hozammal kapjuk. A concanavalin A-oszlopon tisztított interferont a ciklohexilcsoportokat, illetve oktilcsoportokat hordozó nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopokon a főcsúcshoz igen közel eső tartományban eluáljuk. Ha a nagynyomású folyadék-kromatográfia során az anyagot először az oktilcsoportokat tartalmazó oszlopon kromatografáljuk, az interferont közvetlenül a főcsúcs előtt oldjuk le, míg ha első oszlopként ciklohexil-csoportokat tartalmazó oszlopot alkalmazunk, az interferont közvetlenül a főcsúcs után eluáljuk. A nagynyomású folyadék-kromatográfiával tisztított emberi fibroblaszt-interferon mintáit (1 pg fehérje) trisz/glicin pufferoldatban, 12,5% vagy 15% nátriumdodecil-szulfátot tartalmazó poliakrilamid gélen elektroforézisnek vetettük alá. Coomassie Blau színezékkel végzett megfestés után egyetlen sávot kaptunk. A vírusellenes vizsgálat eredményeinek elemzése során megállapítottuk, hogy az aktivitás maximuma a megfestett sáv centrumában van. A termék molekulasúlya körülbelül 20 500 (a mérés során összehasonlító anyagokként inarhaszérum-albumint, kimotripszint, citokróm C-t és ribonukleázt használtunk fel). Az emberi fibroblasztinterferon-sáv relatív mozgékonysága a mintában független volt a merkapto-etanol jelenlététől. 2. példa Blau dextrán-sepharose 4B oszlop előállítása 50 g sepharose 4B gélt 1 liter desztillált vízzel mosunk, majd újabb 50 ml desztillált vízben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz enyhe keverés közben 15 g finomra őrölt brómeiánt adunk, és az elegy pH-ját cseppenként adagolt 10 n nátriumhidroxid-oldattal ll±0,2-re állítjuk. Az adagolás során az elegy hőmérsékletét jég beadagolásával 20±5 °C-on tartjuk. 15—20 perc elteltével az elegyhez egy térfogatrész jeges vizet adunk, és a szuszpenziót Büchner-tölcséren ismét 5 térfogatrész 0,01 n sósavoldattal mossuk. Az aktivált gyantát azonnal 50 ml, 1,00 g oldott blau dextránt tartalmazó 0,4 mólos nátrium-karbonátpufferoldatban (pH = 9,5) szuszpendáljuk, és a szusz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
