185321. lajstromszámú szabadalom • Eljárás farmakológiailag hatásos enkefalin analógok előállítására
1 185 321 2 lünk, amely egy 52 °C-ra fűtött lemezfelületre van elhelyezve. A kísérletnél használt egérnek (Cox Standard) szubkután injekciót adunk be, amely a vizsgálandó vegyületböl egy előre meghatározott mennyiséget tartalmaz valamely alkalmas hordozóanyagban oldva vagy szuszpendálva. A vizsgálandó vegyület beadása után 15 perccel az egeret a fűtött lapra tesszük. Azt a reakció időt mérjük másodpercekben, amely az állat elhelyezése és a forró lemezről való felugrása között eltelik. Egy fájdalomcsillapitó hatással rendelkező hatóanyag az említett reakcióidőt megnyújtja a kizárólag hordozóanyaggal kezelt kontroli-állatéhoz képest. Ezt a tesztet azon dózistartományon belül kell véghezvinni, melynél motoros inkoordináció vagy inkapacitáció (vagyis a mozgató izmok rendezetlen működése, illetve a teljes mozgásképtelenség) még nem lép fel. A következő táblázatban a fenti teszt során kapott ED50 értékeket tüntetjük fel. Az ED50 kifejezés azt a dózist jelenti, amely a vizsgált egerek 50%-ánál analgéziát eredményez. Az analgézia meghatározása jelen esetben a vizsgált vegyület jelenlétében észlelt válaszreakció ideje, amelynek egyenlőnek vagy nagyobbnak kell lennie, mint a kontroli-állaté, emellett a kontroli-állat reakcióidejéhez hozzá kell adni a standard eltérés kétszeresét. A százalékban kifejezett analgézia-adatot át kell alakítani „probií”-ekké és az ED50 értéket a dózisra adott válaszok regresszív analízisével számítjuk ki. Az egyes dózisokra adott válaszokat kifejező görbéknek legalább 4 meghatározott ponttal kell rendelkezniük és minden egyes pontot legalább 10 kezelt egér és legalább 10 kezeletlen kontrollegér adatainak felhasználásával kell meghatározni. Az I általános képletű vegyületek fájdalomcsillapító hatásával kapcsolatban feltétlenül meg kell említeni, hogy azok az enkefalin (5) receptorhoz meglepően magas szintű kötődési tulajdonságokkal rendelkeznek a morfin (ju) receptorhoz viszonyítva^ ha a szóban forgó vegyületeket e tulajdonságok vonatkozásában a technika állásából ismert vegyületekkel hasonlítjuk össze. Ezt az enkefalin (Ô) receptor aktivitást az ismert vas deferens (ondóvezeték)-teszttel lehet kimutatni. Az egéren végzett vas deferens-teszt lényege az, hogy 30-40 g testsúlyú kifejlett egerek (Cox) izolált ondóvezetékét (vas deferens) felfüggesztjük 3 ml módosított Krebs-féle oldatban; az oldatot 37 °C on tartjuk és azon 95% oxigénből és 5% szén-dioxidból álló elegyet buborékoltatunk keresztül. A villanyárammal (0,15 Hz, 1 msec, 40 V) végzett ingerlés hatására bekövetkező összerándulást egy izometriás transducer útján Polygraph-on regisztráljuk. A vizsgálandó vegyületet 20-30 yul-nyi alikvot részletekben adjuk hozzá a fürdőhöz. A dózishatásgörbét a fürdőhöz adagolt vegyület megfelelő mennyiségeinek kumulatív összeadása diján szerkesztjük meg. A viszonylagos agonista potenciál összehasonlítását a ö-receptor tekintetében az IC50 értékek alapján végezzük (az a koncentráció, amely az elektromos árammal kiváltott kontrakciókat 50%-kal csökkenti). A következő táblázat az I általános képletű vegyületekkel az egéren végzett vas deferens-tesztek eredményeit is tartalmazza. Az 1 általános képletű vegyületek nagyfokú kötődése az enkefalin (§) receptorokon szignifikáns és meglepő, ha azt a gyűrűben helyettesítetlen vegyietekével (R = H) hasonlítjuk össze. Táblázat H-L-Ty r-D-Ala-G ly-L-(m-X) Phe- L-B-N H2 X Vegyület B Az egér felugrása (forró lemezteszt) EDS0 mg/kg Vas deferensteszt egéren (ő receptor) IC50, nM Br (N-Me)Met 0,36 0,49 Cl (N-Me)Met 0,11 0,71 I (N-Me)Met _a 2,10 CF3 (N-Me)Met 0,33 1,78 ch3 (N-Me)Met 0,33 2,73 OMe (N-Me)Met 0,15b 2,92 I (N-Me)Met a 2,10 Br PgL a 0,35 II* (N-Me)Met 0,36 12,2 Megjegyzések: a nem vizsgáltuk, bHarlan ND4 egér, *a technika állásához tartozó vegyület. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1 Eljárás az 1 általános képletű enkefalin analógok és gyógyászatban alkalmazható savaddíciós sói előállítására — ebben a képletben A jelentése D-alanilcsoport; X jelentése klór-, bróm-, jódatom, 1-3 szénatomos alkilcsoport, trifluor-metil-csoport vagy 1-2 szénatomos alkoxiesoport;-B-Z együttesen L-(N-metil)-metionin-amid- vagy L- fenil-glicin-amid-csoportot jelentenek - azza ''jellemezve, hogy valamely megfelelően védett I általános képletű vegyületböl - ahol A, X és B-Z jelentése a fenti - a védőcsoportokat egy arra alkalmas reagenssel lehasítjuk, majd kívánt esetben a gyógyászatban alkalmazható savaddíciós sóvá alakítjuk. 2 Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja L-*irozil-D-aianil-glicil-L-m-bróm-fenil-alanil-L-(N0í-metil)-metionin-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy az L-tirozil-D-alanil-glici]-L-m-bróm-fenil-alanil-L-(N0:-metil)-metionil-bcnzhidri!-amin-gyanta trifluor-acetátját vízmemes, cseppfolyósított hidrogén-fluoriddal, majd ecetsavval reagált atjuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja L-tirozil-D-alanil-glicil-L-m-metoxi-fenil-alanil-L(N°- nctil)-metionin-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy NQ'-terc-butil-oxi-karboniI-L-tirozil-D-alanil-glicil-L- m-nutoxi-fenil-alanil-L-(N“-metil)-metionin-amidot trifluoi-ecetsawal reagáltatunk. 4 Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja L-tirozil-D-alanil-glicil-m-trifluor-metil-fenil-alanil- L-(Na-metiI)-metionin-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy az L-tirozil-D-alanil-glicil-L-in-trifluor-metilfenil alanil-L-(Na-metil)-metionil-benzIiidril-amin-gyanta trifluor-acetátját vízmentes, cseppfolyósított hidrogénfluor iddal, majd ecetsavval reagáltatjuk. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
