185321. lajstromszámú szabadalom • Eljárás farmakológiailag hatásos enkefalin analógok előállítására
1 185 321 2 2. Kétszeri mosás metilén-dikloriddal. 3. Mosás metanol;metilén-diklorid (1:1) eleggyel. 4. Kétszeri mosás metanollal. 5. Mosás metanol : metilén-diklorid (1 :1) eleggyel. 6. Kétszeri mosás metilén-dikloriddal. 7. Háromszori mosás DMF : metilén-diklorid (1 :1) eleggyel. 8. 120 perces kezelés a kívánt aminosavszármazék 2,5 ekvivalens mennyiségét tartalmazó és DMF : : metilén-diklorid (1:1) eleggyel készült oldattal, továbbá 1,25 ekvivalens DCC-et tartalmazó metilén-dikloridos oldattal. 9. Négyszeri mosás DMF : metilén-diklorid (1:1) eleggyel. 10. A 4—6. lépések megismétlése. B. L-Tirozil-D-alanil-glicil-DL-m-bróm-fenil-alanil- L-(N“-metil)-metionin-amid hidrogénfluoridja Az A. pont szerint kapott peptid-gyantát (vagyis a gyantán kötött pentapeptidet) vízmentes, cseppfolyós hidrogén-fluoriddal és „kationfogó”-ként (scavenger) anizollal vákuumban 60 percig 0 °C hőmérsékleten reagáltatjuk. A reakcióelegyből az illékony komponenseket vákuumban eltávolítjuk, majd a peptid-gyantát éterrel trituráljuk és szűrjük a hidrogén-fluorid valamint az anizol maradványainak eltávolítása céljából. A peptidet a gyantáról 10%-os ecetsavval végzett triturálással extraháljuk. A 10 %-os ecetsavval kapott kivonatot liofilizáljuk és Így 533 mg cím szerinti nyers vegyületet kapunk. C. A végtermék kinyerése kromatográfiás tisztítási művelettel A peptid-diasztereomerek nyers elegyét 5X72 cm-es oszlopon, fordított fázisban (Cjg) szilikagélen, alacsony nyomást (6,3 kg/cm2) alkalmazva kromatografáljuk, amihez 28% acetonitrilt tartalmazó 0,1 n ammóniumacetát-oldatot használunk. 2000 ml eluátum után másfél percenként 17,1 ml-es frakciókat veszünk, majd a 78- 115. frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A liofilizált terméket 0,2 n ecetsavas oldatban Sephadex G-10-et tartalmazó 2,5X100 cm-es oszlopon kromatografáljuk az ammónium-acetát maradványainak eltávolítása céljából. A frakciókat liofilizáljuk és így amorf, fehér, szilárd anyag formájában 198,7 mg cím szerinti vegyületet kapunk. Az anyag fizikai állandói: [a]p =+20,4° (c = 0,5, ln HC1), HU; = +75,4° (c = 0,5, InHCl). Analízis a C31H43BrN608S (739,697) képlet alapján: számított: C = 50,34%, H = 5,86%, N = 11,36%, Br= 10,80%; talált: C = 50,11%, H = 5,56%, N = 11,07%, Br = 11,03%. Aminosav-analízis: Tyr Alá Gly m-BrPhe nh3 Peptid % (1) 1,00 0,99 0,99 1,01 0,91 103 (2) 1,00 0,99 1,00 1,01 0,93 99 2. példa L-Tirozil-D-alanil-glicil-L-m-metoxi-fenil-alanil- L-(N“-metil)-metionin-amid-acetát előállítása A. N“-terc-Butil-oxi-karbonil-DL-m-metoxi-fenilalanil-L-(N“-metil)-metionin-amid 1,29 g (6,47 mmól) N“-metil-metionin-amid-hidroklorid 7,0 ml hideg (0 C) DMF-dal készült szuszpenziójához hozzáadunk 1,11 ml (6,47 mmól) DIEA-t. Ezután az etegyhez 5,0 ml DMF-ban oldott 1,91 g (6,47 mmól) Boc DL-(m-MeO)-Phe-OH-t, majd 1,75 g (12,9 mmól) HBT-t és 13 ml DMF-ban oldott 1,33 g (6,47 mmól) DCC'-et adunk. A kapott reakcióelegyet kalcium-szulfátot tartalmazó (CaSO„) szárítócső alkalmazása mellett 0 °C-on 4 órán át, majd szobahőmérsékleten 16 órán át keverjük. A diciklohexil-karbamid eltávolítása céljából az e:egyet szüljük, majd a szűrletet vákuumban bepároljuk és így egy narancsszínű maradékot kapunk. Ezt a maradékot 100 ml etil-acetátban oldjuk. Az etil-acetátos oldatot sorrendben először háromszor 100-100 ml vízzel, majd háromszor 100-100 ml 10-es pH-jú pufferoldattal, ezután háromszor 100-100 ml 0,1 n sósavoldattal, végül ismét háromszor 100-100 ml vízzel mossuk. Az etil-acetátos fázist vízmentes magnéziumszulíat felett szárítjuk, szűrjük és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. Ily módon 2,23 g (81%) cím szerinti vegy ületet kapunk. Az anyagban vékonyréteg-kromatográf ás módszerrel (tic) DCU jelenlétét lehet kimutatni. E. DL-m-Metoxi-fenil-alanil-L-(NQ-metil)-metioninamid-hidroklorid Az A. pont szerint előállított 2,23 g (5,24 mmól) vegyület 10 ml ecetsavval készült oldatához hozzáadunk 1,6 ml anizolt és 16,2 ml 1,62 n ecetsavas hidrogén-klorid-oldatot. A kapott oldatot kalcium-szulfátos szár'tócső alkalmazása mellett, szobahőmérsékleten egy óráig keverjük, majd 470 ml éterrel hígítjuk. A kapott csapadékot kiszűrjük, háromszor 15-15 ml éterrel mossuk és 25 °C hőmérsékleten vákuumban szárítjuk, így a cím szerinti vegyületből 1,53 g-ot (81%) kapunk. C. N“-terc-Butil-oxi-karbonil-L-tirozil-D-alanil-glicil- DL-m-metoxi-fenil-alanil-L-(N0:-metil)-metioninamid Boc-L-Tyr-D-Ala-Gly-OH diciklohexil-amin sójából 2,48 g-ot (4,2 mmól) hozzáadunk 7,0 ml dimetil-formamidhoz (DMF). A reakcióelegyet acetonos-jeges hűtőfürdővel -10 °C-ra lehűtjük. Ezután az elegyhez 0,09 ml (0,84 mmól) N-metil-morfolint és 0,55 ml (4,2 mmól) klórhangyasav-izobutilésztert adunk, majd az elegyet 2 percig keveijük. Ezután a reakcióelegyhez hozzáadjuk a B. pont szerinti termék (1,51 g, 4,2 mmól) és 0,47 ml (4,2 mmól) N-metil-morfolin eiegyének 16,5 ml DMF- dal készített és -10 °C-ra lehűtött oldatát. Az így kapott reakcióelegyet kalcium-szulfátos szárítócső alkalmazása mellett, olvadó jeges-acctonos hűtőfürdőben 16 órán át keveijük. Az elegyet az oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából szűrjük és a szűrletet vákuumban bepároljuk. így sárga színű maradékot kapunk, ezt 50 ml etil-acetát és 50 ni víz között megosztjuk és a fázisokat egymástól elválasztjuk. A vizes fázist három ízben, alkalmanként 50- 50 ml etil-acetáttal mossuk, és az egyesített etilacetátos oldatokat előbb háromszor 50- 50 ml 5 %-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd háromszor 50-50 ml 1,5 n citromsavoldattal, végül háromszor 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
