185320. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív enkefalin-származékok előállítására
1 185 320 2 Analízis a Cçü^NjOClBr (279,6) képlet alapján: számított: C: 38,67%, H: 4,33 %, N: 10,02%; talált: C: 38,55%, H:4,41%, N: 10,00%. h) lépés Na-Ciklopropil-metil-L-m-bróm-fenil-alanin-amid 50 ml vízmentes etil-alkoholhoz hozzáadunk 4,2 g (0,015 mól), a g) lépésben leírt módon kapott terméket, majd 5,4 g (0,06 mól) szilárd, vízmentes nátrium-hidrogén-karbonátot és 2,04 g (0,015 mól) ciklopropil-metilbromidot. A reakcióelegyet 7 órán át forraljuk, majd az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk 20 ml kloroformban, és a kloroformos oldatot felvisszük egy 3X40 cm méretű, Grace and Davison grade 62 szilikagél kloroformmal készült szuszpenziójával töltött oszlopra. Az oszlopot kloroform és metanol olyan clcgyével eluáljuk, amelyben a metanol mennyiségét fokozatosan, 10%-ig növeljük. A kromatografálást vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal követjük, és a megfelelő frakciókat egyesítve 2,2 g (hozam: 49%) cím szerinti vegyületet kapunk. NMR-spektrum: ő 1,6 (-NH—), és 7,0—7,4 (m-brómfenil). 10 15 20 25 i) lépés Na-tercier-butoxi-karbonü-D-alanil-glicil-L(Na-ciklopropil-metil)-m-bróm-fenil-alanin-amid 40 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 2,l g (7, l mmól), a h) lépésben leírt módon kapott terméket. A termékhez 0 °C hőmérsékleten hozzáadunk l ,87 g (7,l mmól) Na-tercier-butoxi-karbonil-D-alanil-glicint, majd 0,96 g (7,l mmól) l-liidroxi-benzotriazolt és l ,46 g (7,l mmól) diciklohexil-karbodiimidet. Az elegyet 4 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd 72 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 0 °C hőmérsékletre hűtjük, a kivált csapadékot kiszűrjük, és a szú'rletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot feloldjuk etil-acetátban, és az oldatot először 1 normál nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, utána vízzel, ezután 1,5 nonnál citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk, magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon olaj formájában 1,5 g (hozam: 40%) cím szerinti vegyületet kapunk. 35 40 45 j) lépés 50 Na-Tercier-butoxi-karbonil-Na-metil-L-tirozil- D-alanil-glicil-L-(Na-ciklopropil-metil)-m-brómfenil-alanin-amid ^ 50 ml trifluor-ecetsav és 5 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 1,5 g (2,9 mmól), az i) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keveijük, majd az oldószert melegítés nélkül, csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradék olajat dietil-éterrel eldörzsöljük, a felülúszót leöntjük, és a maradék olajat csökkentett nyomáson megszárítjuk. 15 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 0,856 g (2,9 mmól) NQ-tercier-butoxi-karbonii-N“-metil-L-tirozint. Az elegyhez —15 °C hőmérsékleten, keverés közben, gyorsan hozzáadunk 0,32 ml (2,9 mmól) N-metilmorfolint és 0,38 ml (2,9 mmól) klórhangyasav-izobutilésztert. A reakcióelegyet -15 °C hőmérsékleten keverjük, és ez alatt elkészítjük az alábbi elegyet: A jelen reakciólépés első bekezdésében leírt módon kapott tripeptid-trifluor-ecetsavas sót feloldjuk 10 ml dimetil formamidban. Az oldathoz 0 °C hőmérsékleten egyszerre hozzáadunk 0,32 ml (2,9 mmól) N-metilmorfol nt, és az elegyet a reakció teljessé tétele céljából keverjük. Az így kapott elegyet ezután hozzáadjuk a jelen reakciólépés második bekezdésében leírt módon kapott vegyes anhidrid oldatához. A reakcióelegyet 4 órán át —15 °C hőmérsékleten keverjük, majd hagyjuk lassan szobahőmérsékletre melegedni, és éjszakán át tovább keverjük. Utána 1 normál nátrium-hidrogénkarbonát-oldatra öntjük, és a vizes elegyet etil-acetáttal kirázzuk. A szerves részt elválasztjuk, és vízzel, utána 1,5 normál citromsav-oldattal, majd megint vízzel mossuk, magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot (súlya: 1,6 g) acetonban oldva felvísszük két preparatív vékonyréteg-kromatográfiás lemezre. A lemezeket kloroform és metanol 9 :1 elegyében futtatjuk. A főterméket tartalmazó sávot lekaparjuk a lemezekről, és a terméket a szilikagélről leoldjuk. Ily módon 0,8 g (hozam: 39 %) cím szerinti vegyületet kapunk. k) lépés Na-Metil-L-tirozil-D-alaml-glicil-L-(Na-ciklopropilmetil)-m-bróm-fenil-alanin-amid ecetsavas sója 15 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 0,8 g (1,2 mmól), a j) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet félórán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd fagyasztva szárítjuk. Az ily módon kapott szilárd anyagot feloldjuk 9,0 ml, 31% acetonitrilt tartalmazó, 0,1 mólos anrmónium-acetát-oldatban. Az oldatot felvisszük egy 4X72 cm méretű, C18 fordított fázisú szilikagéllel töltött, nagy nyomású folyadék-kromatográfiás oszlopra. Az oszlopot 4,2 kg/cm2 nyomás mellett eluáljuk, és a kromatografálást 280 nm hullámhossznál spektrofotometriásán követjük. A megfelelő frakciókat egyesítjük, és fagyasztva szárítjuk. A kapott szilárd anyagot feloldjuk 10 ml, 0,2 mólos ecetsavban, és az oldatot felvisszük egy 2,5X100 cm méretű G-10 Sephadex oszlopra, amelyet előzőleg ugyanezzel az oldattal hoztunk egyensúlyba. Az elúciót 280 nm hullámhossznál spektrofotometriásán követjük, a megfelelő frakciókat egyesítjük, és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 773 mg (hozam: 97 %) cím szerinti vegyületet kapunk. [a]jj = 4-6,64° (c = 0,5, 1 normál sósav). Analízis a C3oH40N507Br (662,6) képlet alapján: számított: C: 54,38%, H:6,09%, N: 10,57%: talált: C: 54,30%, H:5,99%, N: 10,28%. A ninosav-analízis: Alá, 0,97; Gly, 1,03; NH3, 0,99. Az 1. példában leírt módon állítjuk elő az alábbi vegyileteket: 2. példa L-(N-metil)-tirozil-D-alanil-glicil-L-(N-etil)-m-brómfenil-alanin-amid ecetsavas sója [cíjp =4-7,1° (c = 0,5, 1 normál sósav). 7
