185312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminosav- és peptid származékok védőcsoportjainak eltávolítására cseppfolyós ammóniában fém nátriummal

I

185 M2

2

A találmány tárgya új eljárás a védőcsoportot tartalmazó aminosav- és peptidszármazékok N- benziloxikarbonil-, O- és S-benzil, valamint N-ptoluolszulfonil-védöcsoportjainak cseppfolyós ammóniában, fémnátriummal történő eltávolítására. -A biológiailag aktív peptidek szintézisének stratégiáját rendszerint úgy tervezik, hogy az utolsó lépésben a védett származékról egy lépésben lehessen eltávolítani az összes védöcsoportot. Az egyik és azóta is általánosan használt eljárás a végső 1C védőcsoport-eltáyolításra a cseppfolyós ammóniában nátriummal végzett redukció (du Vigneaud, V. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 52, 4500 [1930]; Schifferd, R. H. és du Vigneaud, V., J. Biol. Chem.

108, 753 [1935]), amelynek alkalmazását gyakran 15 az indokolja, hogy a védett peptidek nem vagy nehezen vihetők oldatba a szokásos oldószerekkel, illetve részlegesen bomlanak más védőcsoport-eltávolítási reakciók körülményei között. A cseppfolyós ammóniában nátriummal végzett redukciót 2Ci mindig úgy valósítják meg, hogy a reakció végpontját a nátriumfelesleget jelző kék szín megjelenéséhez kötik (Shifferd, R. H. és du Vigneaud, V., J.

Bioi. Chem. 108, 753 [1935]; Patterson, W. I. és du Vigneaud, V., J. Bioi. Chem. 111, 393 [1935]; Lutz, 2Í’ W. B. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 81, 167 [1959]; Hoffmann, K. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 82, 3721 [I960]; du Vigneaud, V. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 76, 3115 [1954];

Li, C. H. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 83, 30 4449 [1961]; Marglin, A. és Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 88, 5051 [1966]; Katsoyannis, P. G. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 93, 5871 és 5877 [1971]; Kisfaludy L. és munkatársai, 151 959 sz. magyar szabadalmi leírás; Ohta, N. és munkatár- 3tí sai, Chem. Pharm. Bull, 27, 2968 [1979]; Kawasaki,

K. és munkatársai, Chem. Pharm. Bull. 28, 2105 [1980]; Tzougraki, C és munkatársai, Int. J. Peptide Protein Rés. 5, 377 [1980]). A nátriumfeleslegel jelző kék színt pár másodperctől (Okada, Y. és 40 munkatársai, Chem. Pharm. Bull. 27, 3015 [1979])

45 percig terjedő ideig (Tzougraki, C. és munkatársai, Int. J. Peptide Protein Rés. 5, 377 [1980]) szokták fenntartani.

A cseppfolyós ammóniában nátriummal végzett 45 redukciót a szerves és peptidkémiában általánosan alkalmazzák az N-henzil-oxi-karbonil-, az O- és

S-benzil- valamint az N-tozilcsoport eltávolítására.

A védett aminosav- és peptidszármazékok csepp- 50 folyós ammóniában nátriummal végzett redukciója során számos, nemkívánatos mellékreakciót mutattak ki: a metionin teljes demetilezödését (Stekol,

J. A., J. Bioi. Chem. 140, 827 [1941]; Dekker, C. A. és munkatársai, J. Biol. Chem. 180, 155 [1949]; 55 Hope, D. P. és Humpries, J. F., J. Chem. Soc. 1964, 869), a prolin pirrolidingyürüjének felnyílását (Ramachadran, J., Nature 206, 927 [1965]), a különböző acil-proiin kötések, különösen a Lys-Pro, Arg- Pro, Thr-Pro és Ser-Pro kötés hasadását (Gutt- 61 mann, S., Peptides 1962 [szerkesztő: Young, G. T.], Pergamon Press, Oxford, 1963, 41. oldal; Merrifield, R. B. és Marglin, A., Peptides 1966 [szerkesztők: Beyermann, H. C. és munkatársai], North- Holland Publ. Co., Amsterdam, 1967, 85. oldal; 65

Katsoyannis, P. G. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 93, 5871 és 5877 [1971]; Benisek, W. F., Biochemistry 6, 3780 [1967]; Hofmann, K. és Yajima,

H., J. Am. Chem. Soc. 83, 2289 [1961]), az arginin részleges átalakulását ornitinné (Guttmann, S., Peptides 1962 [szerkesztő: Young, G, T.], Pergamon Press, Oxford, 1963, 41. oldal), a ciszteinszármazékok részleges átalakulását alaninná (Gebauer- Fuelnegg, E., J. Am. Chem. Soc. 52, 4910 [1930]; Zahn, H. és munkatársai, Peptides 1966 (szerkesztők: Beyermann, H. C. és munkatársai), North- Holland Publ. Co., Amsterdam, 1967, 108. oldal; Shimonishi, Y. és munkatársai, Z. Naturforsch. 24b 422 [1969]), a szerin (Wünsch, E., Coll. Czech. Chem. Commun. Spec. Issue 24,141 [1959]; Rudinger, J. és Massen van der Brink-Zimmermanová, H., Helv. Chim. Acta 56, 2216 [1973]), a treonin (Brenner, M., Coll. Czech. Chem. Commun. Spec. Issue, 24, 141 [1973]), a triptofán (Bajusz, S. és Medzihradszky, K., Peptides 1962 [szerkesztő: Young, G. T.],P ergamon Press, Oxford, 1963, 49. oldal) bomlását, acilvándorlást (Zimmermanová, H. és munkatársai, peptides 1963 [szerkesztő: Zervas, L.], Pergamon Press, Oxford, 1965, 21. oldal; Poduska, K. és munkatársai, Coll. Czech. Chem. Commun. 30, 2410 [1965]) és racemizációt (Arnstein, H. R. V. és Morris, D., Biochem. J. 76, 318 [I960]; Brenner, M. és Pfister, R. W., Helv. Chin. Acta 34, 2085 [1951]; Hanby, W. E. és munkatársai, J. Chem. Soc. 1950, 3239; Hope, D. B., Peptides 1968 [szerkesztő: Bricas, E.], North-Holland Publ. Co., Amsterdam, 1968, 111. oldal).

Több esetben, főleg az oxitocin-szintézisek során azt tapasztalták, hogy a reakciók nagyobb méretben való megvalósítása a hozam rohamos csökkenésével jár együtt (Bodanszky, M. és du Vigneaud,

V., J. Am. Chem. Soc. 81, 25Ö4 [1959]; Sakakibára,

S. és munkatársai. Bull. Chem. Soc. Japan 38, 120 [1965]); például Bodanszky és du Vigneaud néhány milligrammos méretű redukcióban 330-395 NE/mg oxitocin-aktivitást, viszont 1,3 g védett nonapeptidamidot redukálva már csak 170 NE/mg oxitoxin-aktivitást ért el.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a védőcsoportot tartalmazó aminosav- és peptidszármazékoknak, valamint az oxitocin védett nonapeptidamidjának a redukciója során a védőcsoportok teljes eltávolításához, illetve az optimális hozam és a legnagyobb elérhető kémiai tisztaság eléréséhez nincs szükség annyi nátrium beadagolására, amennyi a nátrium fölöslegét jelző tartós kék színt eredményezi. Részletes vizsgálataink alátámasztják, hogy az eddigi gyakorlatban alkalmazott módszer során nemcsak a védőcsoportok eltávolítása igényel nátriumot, hanem - a peptid aminosavössz.etctclélöl függő mennyiségben - a sóképzésre és a nemkívánatos reakciókban is fogy nátrium. Kísérleteink során különböző aminosav- és peptidszármazékok cseppfolyós ammóniában készült oldatához tartós kék szin megjelenéséig adagoltuk a nátriumot g-atom/mó! peptid adagokban. Bebizonyosodott, hogy sót képeznek fém-nátriummal a karboxilcsoportok, a hidroxilcsoportok, a karboxidcsoportok, a merkaptocsoportok, valamint az N-benziloxikarbonil-csoport hasításakor képződő

2