185264. lajstromszámú szabadalom • Javított mikrobiológiai eljárás androsztán szteroidok előállítására
1 .185264 2 pl. valamely szterinnek, illetve 3-helyzetü szterinészternek vagy szteroléternek 4-én-3-on származéka, l,4-dién-3-on származéka, pl. koleszt-4-én-3- on, koleszta-4,22-dién-3-on. 3ß-hidroxi-23,24-bisznorkol-5-én-22-sav, 3-oxo-23,24-hisznorkol-4-én-22-sav (továbbiakban: 4BN), 3-oxo-pregna- 4,17(20)-dién-20-karbonsav, metil-3-oxo-pregna- 4,17(20)-dién-20-karboxilát, kolsav, litokolsav stb. A találmány lényeges jellemzője, hogy - száraz állapotra értelmezett - legalább 0,1 s%-ban tojássárgáját tartalmazó tenyészközeget alkalmazunk. . A tojássárgája adagolható nyers, szárított, vagy fagyasztott alakban. Adagolás előtt elkülöníthetjük a tojásfehérjétől, de akár az egész tojást is a tenyészközeghez adhatjuk anélkül, hogy a tojásfehérjét attól elkülönítenénk, mely utóbbi esetben a tojáshéjat viszont általában eltávolítjuk. A tojássárgája ezen különböző alakjai közül az ipari méretű előállításban legelőnyösebb a szárított tojássárgája. A tenyészközegben a tojássárgája-tartalom legalább - száraz állapotra vonatkoztatott - 0,1 s% és legfeljebb 3 s%-nyi tojássárgája-tartalom általában elegendő. Ha a tojássárgája mennyiség túl kicsi, annak hozzáadásával számottevő javító hatás nem érhető el. Ugyanakkor nem előnyös tojássárgájából túl nagy mennyiséget adni a tenyészközeghez, mert az ilyen mennyiségű adalék hajlamos arra, hogy inhibitálja a mikroorganizmust. A nyers tojássárgájának víztartalma általában 45-50 s%. A tojássárgáján kívül szénforrásokat, nitrogénforrásokat és szervetlen anyagokat adhatunk alkalmasan választott arányban a találmány szerinti eljárásban alkalmazott tenyészközeghez. Szénforrásként alkalmazható egyebek között valamely szénhidrogén, pl. valamely n-paraffín, aolefin, vagy xilol; valamely alkohol, pl. metanol, etanol, glicerol, hosszú szénláncú alkohol; valamely szerves sav, pl. borostyánkősav, ecetsav, hoszszú szénláncú zsírsavak és sóik; gliceridek, olajok és zsírok, pl. szójababolaj vagy gyapotmag-olaj; továbbá szénhidrátok, pl. keményítő, malátacukor, nádcukor, glükóz és ramnóz. A tenyésztési közegbe keverhetők természetes tápanyagok is, melyek szénforrásokat, nitrogénforrásokat, egyél) tápforrásokat tartalmaznak. Ilyenek pl. a melaszok, beleértve a legnagyobb szénláncú melaszokat és a xilóz melaszokat; sajtolt cukornád, kukoricacső, lucerna, kukorica-áztatólé, desztillációs maradékok, mieki (aminosavak elegyének vizes oldata, melyet szójababolajos őrlemény hidrogén-kloriddal végzett hidrolízise útján nyernek), halliszt, korpa, húskivonat, élesztő, élesztőkivonat, burgonyakivonat, malátakivonat, sikér, pepton, glutamátok, aszparagin, glicin, kazein, kazeinhidrolizát, fölözött tej; növényi olajos őrlemények, pl. szójabablepény, repcehulladék, szezámliszt, lenmagliszt és gyapotmagliszt; továbbá olajos magvak és termények, pl. egész szójabab, repcemag, szezám, lenmag és gyapotmag. Szervetlen anyagként adhatók a tenyészközeghez egyebek között nitrogénforrások, pl. ammóniumszulfát, ammónium-klorid stb.; kálium- és foszforforrások, pl. dikálium-hidrogén-foszfát; vas, réz, magnézium, mangán, kobalt, cink, kálcium stb. sói; termények sűrítményei, pl. melaszok. Más komponenseket is adhatunk szükség szerint a tenyészközeghez, pl. vitaminokat. A tenyészközeg összetétele függ az alkalmazott mikroorganizmustól. A tenyészközeg kritikus komponensei a szénforrások, nitrogénforrások, a kálium, foszfor, magnézium. Szükség szerint habzásgátló reagenst, pl. polioxialkilén-glikolt is adhatunk a tenyészközeghez, de arra nincs mindig szükség. A tenyészközeghez előnyösen felületaktív anyagot is adunk, mely a szterolra emulzióképzőként hatékony. Előnyösen ez nem ionos vagy aniqnos szer, pl. polioxi-etilén-szorbit-monosztearát, szorbit-monopalmitát vagy polietilén-glikol-monosztearát. Általában az inkubációs hőmérséklet 20 és 40 °C közötti, leginkább 25-35 'C. A tenyészközeg pH-ját általában 5-10, előnyösen 6-9 közötti értékre állítjuk be. Minthogy a találmány szerint az M. nemzetséghez tartozó mikroorganizmust használunk, a törzs ellenállóképessége még olyan közegben is kielégítő, melynek magas, pl. 10 körüli a pH-ja. A találmány szerinti eljárás kiindulási anyagát képező szterint általában a tenyészközeggel együtt sterilizáljuk, de azt az inkubáció megkezdése után is hozzáadhatjuk a közeghez akár egyszerre, akár adagonként. Az utóbbi esetben a szterint előbb száraz vagy nedves melegben sterilizáljuk, majd akár ebben az állapotában adjuk a tenyészközeghez, akár alkalmas oldószerben, pl. dimetil-formamidban (DMF) feloldva vagy finoman diszpergált szuszpenzióként, melyet ultrahangos kezeléssel készítünk. Előnyösen ezzel egyidejűleg adunk a tenyészközeghez felületaktív anyagot, mert ilyen hozzáadás esetén gyorsul a szterol szubsztrátum emulgeálása. Az inkubáció időtartama nem kritikus. Általában a képződő androsztán szteroid mennyisége a kiindulási anyag (szterin) hozzáadásától számított két nap múlva hirtelen megnő. Ezután a képződő androsztán szteroid mennyisége az inkubációs idővel arányosan, fokozatosan nő. 20 napot meghaladó inkubáció viszont az ipari folyamat eredményességét már alig növeli. , Az inkubáció befejezése után a fermentációs tápközegben képződött androsztán szteroidot bármely ismert módon dúsíthatjuk, elkülöníthetjük, tisztíthatjuk. A tápközeget pl. néhányszor extrahálhatjuk valamely vízben nem oldódó szerves oldószerrel, pl. etil-acetáttal. Az extraktumot az oldószer eltávolítása céljából ezután bepároljuk, majd a maradék szteroid elegyet oszlopkromatográfiásan kezeljük a kívánt androsztán szteroid elkülönítésére, adszorbensként porózus gyantát, szilikagélt, aluminát stb., eluensként petróleum-étert, benzolt, kloroformot, étert, acetont, metanolt, etil-acetátot stb. alkalmazva. Általában azonban úgy választhatjuk meg az inkubáció körülményeit és az extraháló oldószert, hogy a fermentációs tápközeg oldószeres extrahálásával nyert extraktumot már túlnyomórészt a kívánt androsztán szteroid alkossa. Ilyen esetben a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
