185021. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklusos hexapeptidek előállítására
1 2 18. példa A 16. példában megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy szubsztrátként aculeacin A-t használunk, előállítjuk és tisztítjuk az A-30912 A alapevegyületet. 19. példa A. Az A-30912 B alapvegyület komponens dezacilezése Az 1. példában megadottak szerint eljárva, az I. termelő táptalajt használva, az A. utahensis fermentációját végezzük el. A tenyészetet 48 órán át inkubáljuk, majd metanolban oldott A-30912 B komponenst adunk a tenyészethez. Az A-30912 B komponens dezacilezését papírkorong módszerrel, Candida albicans vagy Neurospora crassa mikroorganizmussal kivitelezett érték-méréssel követjük. A fermentációt addig folytatjuk, míg a dezacilezés teljessé válik, amit a biológiai aktivitás megszűnése jelez. B. Az A-30912 B alapvegyület izolálása Az előző A. pontban megadottak szerint előállított teljes fermentlevet szűrjük. A micéliumot kidobjuk. A tiszta szűrletet HP-20 gyantából (Diaion High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japán) készült oszlopon kromatografáljuk. Az effluenst kidobjuk. Az oszlopot ezután 8 oszlop-térfogatnyi 6,5—7,5 pH-jú ionmentes vízzel mossuk a szűrt fermentlé eltávolítására. A mosó folyadékot kidobjuk. Ezután víz és metanol 7:3 arányú elegyével eluáljuk az oszlopot. Az eluciót az alábbiak szerint követjük: két alikvot mintát veszünk mindegyik frakcióból. Az egyik mintát kis térfogatúra töményítjük és savkloridot, például mirisztoíl-kloridot adunk hozzá. Ezt a mintát, és a másikat, vagyis a nem kezeltet, Candida albicans mikroorganizmussal szemben érték-mérjük. Ha a nem kezelt minta nem rendelkezik aktivitással, és az acilezett igen, úgy a frakció A-30912 B alapvegyületet tartalmaz. Az A-30912 B alapvegyületet tartalmazó eluátumokat csökkentett nyomáson desztilláljuk, a kis térfogatú sűrítményt pedig fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a nyers alapvegyületet. C. Az A-30912 B alapvegyület tisztítása révén fázisú folyadékkromatográfiával A B. pontban kapott nyers A-30912 B alapvegyületet víz, acetonitril és ecetsav, továbbá piridin 96:1: :1:1 arányú elegyében oldjuk. Az oldatot Lichroprep RP-18 gyantával töltött oszlopon kromatografáljuk. A gyanta szemcsemérete 25^40 n (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, Oh). Az oszlop része egy Chromatospec Prep 100 egységének (Jobin Yvon, 16—18 Rue du Canal 91160 Longjumeau, Franciaország). Az oszlopot 3,5-0,45 atm nyomáson működtetjük, az átfolyási sebesség 60 ml/perc. Oldószerként a fenti oldószer-elegyet használjuk. A vegyületek elkülönítését 280 nm hullámhosszon működő UV-monitorral követjük (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504), amely ISCO Type 6 típusú optikai egységgel van felszerelve. A 280 nm-cs hullámhosszúságon mért abszorpció alapján egyesítjük az A-30912 B alapvegyületet tartalmazó frakciókat, az elegyet csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot pedig fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a tisztított A 30912 B alapvegyületet. 20. példa A 19. példában megadottak szerint eljárva, előállítjuk és tisztítjuk az A-30912 B alapvegyületet, azzal a különbséggel, hogy szubsztrátként tetrahidro-A-30912 B alapvegyületet használunk. 21. példa A. Az A-30912 D komponens dezacilezése Az 1. példában megadottak szerint eljárva, I. termelő-táptalajt használva fermentáljuk az A. utahensis mikroorganizmust. 48 órán át inkubáljuk a tenyészetet, majd kevés metanolban oldott A-30912 D komponenst adunk a tenyészethez. Az A-30912 D komponens dezacilezését papírkorong módszerrel, Candida albicans vagy Neurospora crassa mikroorganizmussal kivitelezett érték-méréssel követjük. A fermentációt addig folytatjuk, míg a dezacilezés teljessé válik, amit a biológiai aktivitás megszűnése jelez. B. Az A-30912 D alapvegyület izolálása Az előző A. pontban megadottak szerint előállított teljes fermentlevet szűrjük. A micéliumot kidobjuk. A tiszta szűrletet HP-20 gyantából (Diaion High Prous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japán) készült oszlopon kromatografáljuk. Az effluenst kidobjuk. Az oszlopot ezután 8 oszlop-térfogatnyi 6,5-7,5 pH-jú ionmentes vízzel mossuk a szűrt fermentlé eltávolítására. A mosófolyadékot kidobjuk. Ezután víz és metanol 7:3 arányú elegyével eluáljuk az oszlopot. Az eluciót az alábbiak szerint követjük: két alikvot mintát veszünk mindegyik frakcióból. Az egyik mintát kis térfogatra töményítjük, és savkloridot, például mirisztoil-kloridot adunk hozzá. Ezt a mintát, és a másikat, vagyis a nem kezeltet, Candida albicans mikroorganizmussal szemben érték-mérjük. Ha a nem kezelt minta nem rendelkezik aktivitással, és az acilezett igen, úgy a fakció A-30912 D alapvegyületet tartalmaz. Az A-30912 D alapvegyületet tartalmazó elutumokat csökkentett nyomáson desztilláljuk, a kis térfogatú sűrítményt pedig fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a nyers alapvegyületet. C. Az A-30912 D alapvegyület tisztítása reverz fázisú folyadékkromatográfiával Az A-30912 D alapvegyületet, amelyet a B. pontban nyers alakban kapunk meg, a 19. példában megadottak szerint tisztítunk. A 280 nm hullámhosszon mért abszorpció alapján kiválasztjuk az A-30912 D alapvegyületet tartalmazó frakciókat, csökkentett nyomáson desztilláljuk és fagyasztva szárítjuk, amiután tiszta A-30912 D alapvegyületet kapunk. 22. példa A 21. példában megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy szubsztrátként tetrahidro-A-30912 B-t használunk, előállítjuk és tisztítjuk az A-30912 D alapvegyületet. 23. példa A. Az A-30912 H antibiotikum komponens dezacilezése Az 1. példában megadottak szerint eljárva, I. termelő-táptalajt használva fermentáljuk, az A. utahensis mikroorganizmust. 48 órán át inkubáljuk a tenyészetet, majd kevés metanolban oldott A-30912 H komponenst adunk a tenyészethez. Az A-30912 H komponens dezacilezését papírkorong módszerrel, Candida albicans vagy Neurospora 15 185.021 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
