184991. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin C antibiotikum előállítására új micromonospóra törzzsel
13 184991 14 kukoricalekvár 0,12 kg kalciumkarbonát 0,15 kg pálmaolaj 0,09 kg csapvíz 301 pH=6,8—7,0. Az üzemi oltóanyag előállításához 180 l/ó levegőztetést alkalmazunk, a keverő fordulatszáma 180/perc: a hőmérsékletet 35 °C-on tartjuk. Az ily módon, 66 óra alatt kifejlődött oltóanyagot (térfogat 10%) beoltjuk a 200 1 steril táptalajt tartalmazó fermentorba. Táptalaj összetétele: szójaliszt 8 kg kukoricakeményítő 4 kg ammóniumszulfát 0,9 kg kalcium karbonát 1,2 kg kobaltklorid 160 mg pálmaolaj 0,8 kg csapvíz 2001 pH=6,7—6,9. A fermentációt 35 °C-on folytatjuk le, a levegőztetés mértéke az első 6 órában 6 m3/óra, ezután 9 m3/óra a fermentáció befejezéséig, a keverő fordulatszáma 350/perc. A fermentáció folyamán háromszor: a 36., 60., 84. órában steril, 10 térfogat%-os szuszpenzió formájában 4—4 kg dextrint adagolunk a fermentléhez. A 6 napos fermentáció után a fermentlé táptalajra vonatkoztatott összes gentamicin tartalma 1980 E/ml, %-os megoszlása : gentamicin Cla 26,5%, gentamicin C2 31,4%, gentamicin C2a 11,2%, gentamicin Ct 30,9%. 5. példa A Micromonospora purpurea ssp. luridus KGO—35 (MNG—00209) jelzésű törzs 1. példa szerint előállított oltóanyagával (térfogat 200 ml) beoltjuk a következő összetételű steril inokulum táptalajt (5 m3 térfogatú előfermentorban) ; szójaliszt 30 kg kukoricakemény í tő 30 kg szacharóz 30 kg kalciumkarbonát 12 kg pálmaolaj 3 kg csapvíz 3000 1 pH=6,7—6,9. Az üzemi oltóanyag előállításához 180 m3/óra levegőztetést alkalmazunk, a keverő fordulatszáma 180/perc, a hőmérsékletet 35 °C-on tartjuk. Az ily módon, 78 óra alatt kifejlődött oltóanyagot beoltjuk egy 56 m3 térfogatú csőfermentorba, mely 30 m3, következő összetételű steril táptalajt tartalmaz: szójaliszt 900 kg kukorica keményítő 1 500 kg kalciumkarbonát 180 kg ammóniumszulfát 90 kg kobaltklorid 24 g nátriumklorid 90 kg pálmaolaj 180 kg csapvíz 30 000 1 pH=6,8—7,0. A fermentációt 35 °C-on folytatjuk le; a levegőztetés mértéke az első 12 órában 900 m3/óra, ezután a fermentáció befejezéséig 1800 m3/óra. A fermentáció folyamán a 72. órában, majd a 108. órában 3000— 3000 1 steril vizet adagolunk a fermentléhez. A 6 napos fermentáció során a fermentlé táptalajra vonatkoztatott összes gentamicin antibiotikum tartalma 1450 E/ml ; a gentamicin Cla 22,2%, gentamicin C2 34,1%, gentamicin C2a 11,7%, gentamicin Cj 32,0%. A fermentáció befejezésekor a 37 000 1 fermentlé pH- ját 2,0-re állítjuk, keverés közben, 20%-os kénsawal. Ezután a savazott fermentlevet vákuumdobszűrőn megszűrjük, perlit szűrősegédanyagot alkalmazva. A savas szűrlet pH-ját tömény ammóniumhidroxid oldattal pH=6,5—7,0-ra állítjuk, majd 140 kg oxálsavat adunk hozzá keverés közben. 1 óra keverés után a pH-t 7,5-re állítjuk tömény ammóniumhidroxid oldattal, s a kivált csapadékot — ismét vákuumdobszűrőn, perlit szűrési segédanyagot alkalmazva — leszűrjük. A szűrletből ezután a gentamicin antibiotikumokat megkötjük ammonium ion-formában levő Wofatit CP—300-as gyantán: 3 sorba kapcsolt ioncserélő oszlopot használunk a szűrt fermentlé megkötéséhez, az oszlopok 50—50 liter gyantát tartalmaznak (oszlopok mérete 300 x 1000 mm). Megkötési sebesség 1500 liter/óra. Megkötés és vízzel való kimosás után az oszlopokat.ellenáramban eluáljuk 2 n ammóniumhidroxid oldattal, az eluálási sebesség 15 liter/óra. Összesen 350 liter főeluátumot nyerünk. A főeluátumot vákuumban, 45 °C-on 70 literre bepároljuk, majd aktív szénnel derítjük (4,5 kg Norit C Extra szenet használunk), végül a szűrlet pH-ját 7,0—7,5-re állítjuk és 4 db sorba kapcsolt, egyenként 125 liter, ammonium ion formában levő Amberlit CG—50 gyantát tartalmazó kromatografáló oszlopon megkötjük, 30 liter/óra sebességgel. Az oszlopot megkötés után vízzel mossuk, majd 0,1 n ammóniumhidroxid oldattal megkezdjük a kromatogram kifejlesztését, illetve az egyes komponensek eluálását. Az ammóniumhidroxid oldat adagolási sebessége 60 liter/óra, és összesen 4200 liter 0,1 n ammóniumhidroxid oldatot használunk fel. Azeluálást papír- és rétegkromatográfiás ellenőrzés mellett végezzük, s ennek alapján — a szennyező egyéb aminoglikozidok elválása után — az ammóniumhidroxid oldat koncentrációját 0,3 n-re emeljük. Az analitikai ellenőrzés alapján kiválasztjuk és egyesítjük a 88—105. frakciókat, 1—1 frakció térfogata 60 liter, ezek tartalmazzák a gentamicin antibiotikumokat, majd vákuumban, 45 °C-on bepároljuk a térfogatuk egytizenötödére. A koncentrátum pH-ját 5 n kénsavval 6,0-ra állítjuk, majd aktív szenes derítés után további kénsav adagolással a pH-t 4,5-re állítjuk. Aktív szenes derítés után a pH-t ellenőrizzük, az oldatot szűrjük, végül tízszeres térfogatú szűrt metanolba csurgatjuk, állandó lassú keverés mellett. A kivált terméket vákuumszűrőn szűrjük, abszolút metanollal mossuk, majd vákuumszárítószekrényben, 40 °C-on szárítjuk, végül szitáljuk. A végtermék súlya 43,1 kg, amely hatóanyagként 24,22 kg gentamicin C bázist tartalmaz. Összetétele: gentamicin C,a 22,4%, gentamicin C2 34,4%. gentamicin C2a 11.8%. gentamicin C, 31.4%. 5 10 1.5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
