184972. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán gamma-interferon előállítására
7 184972 8 Ezután a vörösvértestek feloldását a fenti módszerrel megismételjük, azzal a változtatással, hogy 1 térfogatrész fehérvérsejt szuszpenzióra 10 térfogatrész 0,83%-os vizes ammónium-klorid-oldatot alkalmazunk. A leukocitákat az előzőekben ismertetett összetételű tápoldatban 5 szuszpendáljuk és a sejtszámot 107 ml értékre állítjuk be. A tápoldat 2 mg/ml humán agamma-szérumot [„Agámmá szérum” =gamma globulin mentes szérum, mely a szérumok ammónium-szulfátos kezelésével állítható elő a J. gen Virol. 20, 97—104, 1973-as irodalmi helyen kö- 10 zölt módszerrel] és 25 [zg/ml neomicint tartalmaz. A sejteket 4 órán át 37 °C-on állandó keverés mellett 1500 NE/ml pH 2 kezelt (Sendai vírus-mentesített) koncentrált alfa-interferonnal kezeljük. Ezután az előkezelésre használt alfa-interferont Hanks-oldattal történő 15 kétszeri mosással eltávolítjuk, majd a sejteket 15 fjtg/ml Concanavalin A-val kezeljük és 12 órán át állandó keverés mellett 37 °C-on inkubáljuk. A felülúszó (szupernatans) folyadék gamma-interferon tartalma 50 000 E/ml. Összehasonlítás céljából a fenti eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy az inducer hozzáadása előtt a leukocitákat nem kezeljük alfa-interferonnal. A kapott gamma-interferon titere mindössze 6500 E/ml. 2. példa Az 1. példában ismertetett eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy tápoldatként Glasgow-féle MÉM tápfolyadékot alkalmazunk [Virology 14, 359, 1961], Az ily módon kapott nyers gamma interferon hatóanyagtartalma 48 000 E/ml. Amennyiben a jelen példa szerinti eljárásnál az alfainterferonnal történő kezelést elhagyjuk, csupán 6200 E/ml hatóanyag-tartalmú nyers gamma-interferont kapunk. 3. példa Az 1. példában leírt módon járunk el, azonban az előkezelésre használt alfa-interferont nem távolítjuk el. Az alfa-interferonnal való kezelés után a sejteket 15 [Jtg/ml Concanavalin A-val 12 órán át 37 °C-on állandó keverés mellett inkubáljuk. A felülúszó folyadék interferon tartalma 52 000 E/ml. Az ily módon kapott, alfa- és gamma-interferont tartalmazó anyagot CPG üvegkromatográfiás módszerrel választjuk szét komponenseire. A nyers terméket CPG 50 üveggel töltött oszlopra visszük fel, az alfa interferon a szennyezésekkel együtt az oszlopon áthalad, míg a gamma-interferon megkötődik. A gamma-interferon eluálását 20 térfogat% etilén-glikolt, 150 mmol nátrium-kloridot és 20 mmol foszfát-puffért tartalmazó vizes oldattal végezzük el. 4. példa Az 1. példában ismertetett eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy az interferonos kezeléshez alfainterferon helyett 2500 NE/ml beta-interferont alkalmazunk. A kapott nyers termék gamma-interferon tartalma 56 000 E/ml. Amennyiben a jelen példa szerinti eljárásnál a betainterferonnal történő kezelést elhagyjuk, 6800 E/ml hatóanyagtartalmú nyers gamma-interferont kapunk. Szabadalmi igénypontok 20 1. Eljárás humán gamma-interferon előállítására, a vér fehérvérsejt-frakciójának (buffy coat) elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása, a leukocyták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása Valamely mitogén ágenssel történő kezelése, majd az interferon-tartalmú 25 folyadéknak a sejtektől történő elválasztása útján, azzal jellemezve, hogy a fehérvértesteket a mitogén ágenssel történő kezelés előtt 200—20 000 NE/ml mennyiségű alfa- vagy beta-interferonnal előkezeljük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási mód-30 ja, azzal jellemezve, hogy az előkezelést 500—5000 NE/ml mennyiségű, alfa- vagy beta-interferonnal végezzük el. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosltási módja, azzal jellemezve, hogy az előkezelést 1000— 35 2000, előnyösen 1500 NE/ml mennyiségű alfa-interferonnal végezzük el. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az előkezelést 2000— 3000, előnyösen 2500 NE/ml mennyiségű beta-inter-40 feronnal végezzük el. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az előkezelést a mitogénnel történő kezelést megelőzően 1— 12, előnyösen 2—8, különösen előnyösen 4 órával vé-45 gezzük el. 6. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az alfavagy beta-interferonnal történő kezelést 1—12, előnyösen 4 órán át végezzük el. 7. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítás ' módja, azzal jellemezve hogy az előkezeléshez használt alfa- vagy beta-interferont a mitogén ágenssel történő kezelés előtt mosással eltávolítjuk. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 87.2041.66-4 Alföldi Nyomda, Debrecen Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató
