184925. lajstromszámú szabadalom • Eljárás életképes sejtekké visszaalakuló streptomyces protoplasztok előállítására
9 184925 10 Kísérlet száma Sejtoptikai sűrűség (OD) Növekedési szakasz Protoplasztok képződése Telepképző egység OD + Hipertóniás j Hipotoniás táptalaj 2 1,14 exponenciális jó 2,2 xlO7 <4,4 xlO2 2 2,4 késői exponenciális jó 4,7 xlO7 <2,1 xlO2 2 3,81 átmeneti jó 9,1 xlO7 < l,3-j-102 3 4,8 átmeneti jó 1,1 xlO8 <5,0 xlO2 3 4,3 stacioner*** jó 5,8 xlO3 <5,0 xlO2 * Az optikai zavarosságot a protoplaszt-képzés előtt határoztuk meg. NM=Nincs meghatározva. ***10 órával az átmeneti növekedési szakasz után. 3. példa Az 1. példában megadottak szerint eljárva 0,4% glicht tartalmazó Tripticase-szója táptalajon Síreptomy- 20 ces aureofaciens törzset tenyésztünk, a sejtekből protoplasztokat készítünk, a protoplasztokat pedig szélesztjük. A tenyészeteket 34 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a 8. napon meghatározzuk a telepek számát. Mint ahogy az 1. példa szerinti Streptomyces fradiae-val és a 25 2. példa szerinti Streptomyces griseofuscus-szal végzett kísérletek adataiból is kiderül, az átmeneti növekedési szakaszban (A600 ebben az esetben 2,0) lévő sejtekből készített protoplasztok ebben az esetben is sokkal jobb hatásfokkal regenerálódnak, mint a késői exponenciális növekedési szakaszból vett sejtek protoplasztjai. A 3. táblázat adataiból kiderül, hogy az A600 2,4-nél a tenyészet protoplasztjai tízszer hatékonyabban regenerálódnak, mint az A600 0,6-nél. Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg. 3. 'áblázat Kísérlet száma Sejtopiikai sűrűség (OD) Növekedési szakasz Protoplasztok képződése Telepképző egység,'OD + Hipertóniás táp Hipotoniás talaj í 0,6 exponenciális jó 3,5 xlO4 5 8,3 xlO2 í 1,24 exponenciális késői jó 4,6 xlO5 4,0 xlO2 í 2,4 átmeneti jó 3,4 xlO6 2,1 xlO2 * A tenyészet optikai zavárosságát a protoplasztok képzése előtt határozzuk meg. 4. példa A kísérleteket auxotróf Streptomyces fradiae mutánsokkal végezzük. A szülőtörzsek közül legalább az egyik két auxotróf genetikai markert és spektincmicin rezisztenciát (spe) kiváltó markert tartalmaz. Mindegyik genetikailag jelzett S. fradiae törzset 0,4% glicint tartalmazó Tripticase-szója táptalajon tenyésztjük. Amikor a tenyészet optikai zavarossága eléri az A600 1,5—5,0 értéket, centrifugálás közben kétszer mossuk a micéliumot, majd P oldatban (Okanishi és munkatársai, lásd előbb) szuszpendáljuk. Milliliterenként 1—2 mg lizozimot adunk a szuszpenzióhoz. Ezután 30 :C hőmérsékleten 0,5—2 órán át inkubáljuk a micéliumos sejteket. A kapott protoplaszt szuszpenziók 0,5 ml-ét (mindkét szülőtörzsből) összekeverjük. A keveréket centrifugálás közben többször mossuk, miközben P oldatban szuszpendáljuk, végül az üledéket 0,1 ml P oldalhoz adjuk. A sejtmembrán-fúzió kiválasztására 0,9 ml, P oldattal készült 40%-os polietilén-glikol oldatot adunk a szuszpenzióhoz. A protoplasztok fúzióját fáziskontraszt mikroszkóppal ellenőrizzük. A fuzionált protoplasztokat a következő oldatok egyikével azonnal hígítjuk : 40% polietilén-glikolt tartalmazó P oldat, P oldat vagy desztillált víz. A hígított szuszpenziót rekombinálódásra és a prototróf rekombinánsok regenerálására R2 jelű táptalajon (Okanishi és munkatársai, lásd előbb) széleszíjük. A használt R2 táptalaj prolin helyett aszparagint tartalmaz nitrogénforráskent. Az inkubációt 34 CC hőmérsékleten 10—24 napon át folytatjuk, majd meghatározzuk a rekombinánsok számát. A prototróf rekombinánsokat a nem szelektált genetikai marker (spektinomicin rezisztencia) jelenlétének megállapítására vizsgáljuk, amivel kizárjuk a revertálódolt (ellenkező irányú mutációt szenvedett) mutánsokat. A rekombináció bizonyítására további kontroli-vizsgálatokat végzünk. Az összes rekombinánsok számát az összekevert öszszes protoplaszt számához viszonyítva adjuk meg, amely utóbbi érték a hemocitométerrel végzett megfigyelések szerint általában 108 és 109 protoplaszt/ml között változik. Protoplasztok fúziójával kapott több genetikai keresztezés összefoglaló eredményét a 4. táblázatban adjuk meg. 45 50 55 60 65 6
