184814. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinészteráz előállítására

184 814

2

2. példa

Maximális enziinkitermelést általában már 1-2 napos tenyésztés után kapunk.

A koleszterinészteráz lehet mind a fermentiében mind a sejtekben. Felületaktív anyagok, különösen nem ionogén szerek - amelyek előnyösen alkil- és aralkil-csoportokat tartalmazó polioxietilén-éter és -észter típusokhoz tartoznak — hozzáadásával sok mikroorganizmusnál befolyásolható a fermentlé és a sejtek közötti megoszlási arány, rendszerint az extracelluláris aktivitásnak az intracelluláris aktivitás terhére való növekedése irányában, ionogén felületaktív szerek esetében a megoszlás változása viszont általában fordított irányban megy végbe.

A befejezett tenyésztés után a kokszterinészterází szokásos módszerekkel különítjük el a sejttömegből és/vagy a fermentlé szűrletéből, és adott esetben tisztítjuk. Számos célra megfelel azonban már egy tisztítatlan nyerstermék is, amely lényegében csak feltárt sejttömegből áll. Feltárás céljára a szakemberek által ismert módszerek alkalmasak, amelyek itt közelebbi magyarázatot nem igényelnek. Mind a fermentlé szűrletéből mind a feltárt sejttömegből az oldatlan alkotórészek elválasztása után az enzim szokásos lecsapószerekkel, például sókkal, így ammónium-szulfáttal, vagy szerves oldószerekkel, így acetonnal vagy etanollal kicsapható, és utána a szokásos frakcionálási módszerek, például kromatográfia és kicsapás, alkalmazásával tovább tisztítható.

A következő példák a találmányt tovább magyarázzák.

1

1. példa

Mélyhűtött ampullából, ferde táptalajról vett Pseudomonas spec. DSM 1280-at főtenyészet-táptalajon (rázólombikban) két napon át 30 °C-on aerob előtenyésztünk, és azután 10 %-nyit áttoltunk egy olyan táptalajra, amely literenként a következő összetevőket tartalmazza:

7 g Na2H?04 • 2H20,

3 g KHj PO4,

lg nh4ci,

0,05 g NaCl,

0,1 ml 1 %-os FeCl3 oldat,

0,1 ml 0,2 %-os CuCl2 oldat,

0,1 ml 1 %-os ZnS04 oldat,

1.0 ml 10 %-os CaCl2 oldat,

5.0 ml 12 %-os MgS04 oldat,

1,5 % szója-lecitin, pH 7,0.

A tenyésztés 30 °C-on aerob körülmények között, rázólombikban történik. 1—3 nap múlva körülbelül 15000 egység/liter aktivitást kapunk. (Felülúszó és biomassza; szubsztrát: koleszteril-oleát).

Amennyiben lecitint nem alkalmazunk, úgy 20 egység/liter a kapott aktivitás.

Körülbelül hasonló kitermeléseket kapunk, ha azonos körülmények között Pseudomonas spec. DSM 1280 helyett Pseudomonas spec. DSM 1281-et alkalmazunk.

Az 1. példa szerint kapott fermentléből az oldatlan sejt tömeget lecentrifugáljuk, és koleszterinészter-meghatározáshoz elkészítjük, A meghatározás a következő reakcióegyenletek szerint történik'

1. koleszterin-észter + H20 — z> koleszterin -F zsírsav

2. koleszterin + 1/2 O 2 kol--0xtda_2/kataláz>kolesztenon + H202

(A kolesztenon képződés mérése 240 nm-nél.) A méréshez a következő oldatokat használjuk:

1. 0,5 mólos, 7,5 pH-jú foszfátpuffer, 0,4 % Thesit;

2. koieszterin-oleát, c=4, Thesit/dioxán (v/v = 1/1)ben,

U kb. 0,6 mólos hidrogén-peroxid oldat (5 ml pertudról/100 ml);

4. kataláz(0,01 mg protein/ml);

5. koleszterin-oxidáz (legalább 50 egység/ml);

6. fermentlé (körülbelül 5000 egység/iiternél 1:5 hígítás vízzel, vizsgálatra 0,01 ml).

A meghatározáshoz 2,95 ml 1. oldatot 0,02 ml 3. oldattal elegyítünk. Hozzáadunk 5 perc múlva 0,01 ml

6. oldatot és 0,02 ml 5. oldatot, és 1 perc múlva 0,1 ml

2. oldat hozzáadásával beindítjuk a reakciót.

A számítást a következőképp végezzük: * 20

5‘ 0Ú\^ ' E/Perc = egység/liter fermentlé.

3. példa

Mélyhűtött ampullából, ferde táptalajról vett Candida rugósa ATCC 14830-at oltunk az alábbi összetételű táptalajra, ás 48 órán át 28—30 °C-on aerob körülmények között (rázólombik 20/100) tenyésztjük.Utána 10% inokulummal beoltjuk a következő összetételű táptalajt (adatok 1 literre):

20 g szójaliszt GeFu 988 SUP,

20 g oldható keményítő,

5 g K2HP04 ■ 3 H20,

1 g MgS04 • 7 H20, lg (NH4)2S04,

1,5 g szójalecitin, pH 6,6-6,8.

A tenyésztést körülbelül 28 °C-on végezzük, aerob körülmények között. 3—4 nap múlva 1500-2000 egység/'iter aktivitást kapunk. (Felülúszó; szubsztrát: koleszteril-oleát).

Amennyiben a táptalaj lecitint nem tartalmaz, úgy az elért aktivitás 200 egység/liter.

4. példa

Streptomyces antibioticus ATCC 14 888 alkalmazásával végezve a tenyésztési kísérleteket, lecitin jelenlétében 163 egység/liter aktivitást kapunk. Lectin nélkül végezve a tenyésztést, aktivitás nem mutatható ki.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

3